阿霉素致心肌线粒体损伤的分子机制研究进展

李治邑 综述 李妙龄 审校

西南医科大学心血管医学研究所，医学电生理教育部重点实验室，四川省医学电生理重点实验室（泸州 646000）

根据作用方式，可将抗肿瘤药分为：①烷基化剂（如环磷酰胺等）；②抗肿瘤抗生素类药（蒽环类药物，如阿霉素等）；③抗代谢药物（如5-氟尿嘧啶等）；④有丝分裂纺锤体抑制剂或抗有丝分裂药物（紫杉烷类药物，如长春新碱等）；⑤针对分子的药物（如贝沙罗汀等）。阿霉素是抗生素蒽环类药物，在治疗乳腺癌[1]、食道癌[2]、霍奇金淋巴瘤[3]、非霍奇金淋巴瘤[4]、白血病等肿瘤上发挥了重要作用，但慢性或急性作用又可导致机体产生严重的毒副作用使其在临床使用受限。在药物作用的过程中会出现线粒体结构和功能的改变，而线粒体在心肌组织稳态中起着至关重要的作用。阿霉素可干扰线粒体呼吸链（如解偶联）或抑制重要的线粒体酶的活性，进而导致线粒体膜电位的改变和线粒体氧化应激的增加，最终导致心肌细胞和内皮细胞的凋亡。

1 氧化应激损伤

1.1 阿霉素诱导ROS产生

线粒体膜内富含心磷脂，是蛋白质亚基组装和催化功能必不可少的成分[5-6]。阿霉素对这种心磷脂有很高的亲和力，导致阿霉素在心肌细胞内积聚[7-8]。阿霉素进入线粒体，通过与心磷脂结合进而抑制呼吸链[9]，与线粒体膜的结合还可能增加阿霉素与线粒体电子传输链的NADH 脱氢酶（复合物I）在较低浓度下相互作用的机会。

有研究表明，阿霉素氧化还原循环发生在线粒体电子传输链[10]，更具体地说，发生在电子传递链复合体I。阿霉素具有醌的结构，电子传递链复合体I中的各种NAD（P）H 依赖还原酶通过电子还原将阿霉素转化为半醌自由基，这种半醌与分子氧反应生成超氧自由基，从而产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），如过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）、过氧亚硝酸根（ONOO-）等，同时还会释放电子，破坏呼吸链的完整性[7-9]。

CHAISWING等[11]通过计算机定量超微结构观察，发现线粒体是阿霉素损伤心肌最广泛和持续的亚细胞器结构；在阿霉素抗肿瘤治疗后的早期，心肌细胞线粒体中的蛋白质就发生了显著的氧化/硝化翻译后修饰。虽然在过去的实验里几乎都是在体外条件下用超标的阿霉素剂量进行实验，无法证实体内的适用性，但后续有研究用不同剂量进行实验，结果支持阿霉素治疗产生的活性氧主要来源于线粒体的观点[12]。

1.2 阿霉素诱导活性氮自由基的产生

阿霉素激活NAD（P）H 氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，NOXs），从而激活心肌细胞凋亡途径自由基的产生[13]。NOXs激活可能通过线粒体将ROS转化为超氧自由基并与一氧化氮反应生成ONOO-[14]。ONOO-激活基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），这些蛋白酶已被认为是阿霉素产生过氧亚硝酸盐导致心脏毒性的主要机制[15]。有研究发现，用阿霉素治疗后，小鼠心肌细胞中会形成过氧亚硝酸盐[16]；并且有研究证明，阿霉素可诱导一氧化氮合成，从而导致亚硝酸盐在细胞内积聚[17]。

阿霉素在早期诱导线粒体脂质过氧化，随后在所有的亚细胞间形成硝化损伤产物，并在后期引起更广泛的细胞损伤[11]。与MIKKELSEN 等[18]的假设一致，在心脏中氧化损伤先于硝化性损伤，并且硝化性损伤放大了氧化损伤作用[11]。

1.3 阿霉素诱导线粒体通透性改变

阿霉素可增加氧化磷酸化和引起线粒体转换孔复合体功能改变。这种线粒体通透性的改变是阿霉素导致的剂量依赖性改变，线粒体通透性转换会导致线粒体失去在内膜上形成和维持电化学梯度的能力[19]。线粒体蛋白易受到外界刺激的影响，从而导致细胞内氧化应激的增加，线粒体膜渗透性转换可能在调节与阿霉素治疗相关的不良生物能量和功能后果方面发挥了迄今未知的作用[20]。近年已有实验发现在多能干细胞诱导的心肌细胞[21]或大鼠渗透性心肌纤维[22]中阿霉素抑制线粒体呼吸。

1.4 阿霉素诱导氧化应激信号通路活性的增强

阿霉素导致的心肌细胞氧化应激活性增强可致下游信号通路发生一系列的代偿反应，如Keap1/Nrf2/ARE通路的激活[23]或改变MAP激酶和/或PPAR核受体介导的通路[24]。在氧化状态下，Keap1不能与Nrf2结合，从而允许该转录因子在细胞核内积累并激活转录抗氧化反应元件（AU-rich element，ARE）。有文献报道，阿霉素可致大鼠心肌细胞中Keap1的氧化和Nrf2介导的抗氧化反应激活[25]，证明了这些通路参与了氧化应激过程。

2 线粒体中的关键蛋白

2.1 连接蛋白43（Cx43）

连接蛋白43是细胞间信息传递的主要连接蛋白，对离子和小分子的细胞间转运起重要调节作用，并负责不同类型细胞之间的电传递，尤其是心肌细胞[26]。在过去的十年中，Cx43在各种细胞类型的线粒体中的存在已有报道[27]。有研究表明，线粒体Cx43通过减少胞浆和线粒体活性氧的产生，减少线粒体钙超载，减少线粒体膜去极化和细胞色素C 的释放而发挥心脏保护作用。线粒体Cx43通过阻止细胞色素C释放到胞浆中，减少其激活Caspase-3级联反应，从而控制细胞凋亡的启动[28-29]。

线粒体Cx43还参与另一信号转导通路，该通路可阻止线粒体通透孔的形成，从而防止线粒体肿胀、线粒体外膜破裂和产生凋亡的线粒体内容物的释放[30]。

RODRÍGUEZ-SINOVAS等[31]证明缺血预处理通过热休克蛋白90（heat shock protein90，Hsp90）和线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）的有关机制诱导Cx43 从胞浆到线粒体的移位。该系统包括将目标蛋白与伴侣蛋白（Hsp90/Hsp70）结合，传递到TOMM 复合物的特定部分，然后释放到线粒体膜内[32]。Cx43移位到线粒体似乎对某些形式的心脏保护很重要，线粒体Cx43的增加与缺血预处理和心脏保护有关，可能是通过调节线粒体离子的稳态和肿胀而发挥保护作用[33]。

3 铁代谢障碍

3.1 阿霉素导致铁代谢障碍

心脏是最活跃的代谢器官之一，它需要提供心肌细胞活动所需的能量。线粒体在这项任务中起关键作用，而线粒体正常功能所需的微量元素之一是铁。数据表明，心肌细胞中近1/3 的的铁分布在线粒体中[34]。铁是理想的电子传输者，它可以促进生化反应，但也可以诱导活性氧（ROS）的产生，过多的活性氧可能会破坏细胞结构[35]。线粒体需要铁的持续性供应，铁供应的减少会影响细胞产能，铁超载会产生过多的ROS 导致线粒体损伤[36]。有证据支持阿霉素导致铁代谢障碍[37]。铁螯合剂和铁的抑制剂可通过保护线粒体减少阿霉素毒性。此外，阿霉素毒性的严重程度和不同线粒体铁蛋白的活性之间的关系也表明了线粒体铁失调在阿霉素诱导的心脏毒性中的重要性[38-40]。另外，有证据表明，进入线粒体的铁是通过丝裂铁蛋白2和线粒体钙离子单向转运蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）调节的，而铁的输出是通过ATP结合盒B亚家族蛋白维持，如ATP结合盒B亚家族成员8（ABCB8）[19，41-44]。

3.2 铁在阿霉素诱导的活性氧形成中起着至关重要的作用

由过渡金属（如铁）催化的Fenton 反应和Haber-Weiss反应产生ROS。DOX半醌超氧自由基和H2O2可以促进铁蛋白和细胞质乌头酸酶释放铁，从而改变铁的代谢。随后，铁可以与阿霉素反应，产生·OH[9，45]。氧化还原循环释放的活性氧、过渡金属和铁络合物的形成被认为是阿霉素引起的多种心肌有害效应的原因[46]。

4 凋亡

4.1 线粒体基因组DNA（MtDNA）损伤

人们普遍认为DNA 损伤是阿霉素诱导的心肌细胞死亡的早期重要事件[47]。阿霉素进入线粒体，可能通过产生活性氧（ROS）直接或间接地与线粒体DNA（MtDNA）相互作用。线粒体DNA的破坏可能会导致呼吸链功能障碍，进而产生额外的ROS，从而攻击呼吸链本身，再次导致线粒体DNA突变[8]。

直接作用：蒽环类药物，如阿霉素，被称为拓扑异构酶II（TOP2）类药。阿霉素可以通过插入DNA链来阻断DNA的合成，并且可以抑制TOP2的作用。这种酶在不改变脱氧核苷酸的结构和序列的情况下改变DNA的拓扑结构，瞬间导致双链DNA 断裂，进而调节DNA的超螺旋[48]。

间接作用：DNA复合物的产生：①阿霉素在线粒体产生自由基，这些自由基促进脂质过氧化，从而促进丙二醛的产生，丙二醛与脱氧鸟苷、脱氧腺苷和脱氧胞苷的环外氨基反应形成烷基化复合物[48]。②4，6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶（FapyAde）或5-羟甲基尿嘧啶（5-OH-MeUra）等氮碱的氧化损伤也已被证实。这些氧化复合物是高度诱变的产物，可以阻止DNA 复制，并增加DNA聚合酶读取错误的频率。③阿霉素还可以通过NAD（P）H 氧化酶体系和过渡金属与甲醛生成复合物。这种复合物与DNA 形成共价键，根据插入区域的不同，也可以或多或少形成稳定的插层或更稳定的DNA 交联[45]。解旋酶不能分离DNA 链并干扰其解离可能是这些交联导致的，但也可能是由于阿霉素对解旋酶的直接作用引起的[7-8，48]。

4.2 线粒体的凋亡途径

线粒体功能障碍在阿霉素治疗的早期阶段很普遍，可能是细胞凋亡的直接原因[49]。KOTAMRAJU 等最近研究表明，超氧阴离子产生的过氧化氢可能是阿霉素诱导内皮细胞和心肌细胞凋亡的关键氧化剂，线粒体通过释放细胞色素C 导致Caspase 激活和随后的细胞死亡等机制在调节细胞凋亡中起着关键作用[48]。线粒体可对几种信号（即活性氧、氧化还原状态改变和钙水平增加）做出反应，这些信号触发Caspase 激活蛋白的释放，如细胞色素C 和凋亡诱导因子[50]。细胞色素C 从线粒体释放到胞浆中可以导致Caspase-9 的激活，Caspase-9 负责激活效应Caspase，如Caspase-3，从而诱导细胞死亡。有实验表明，Caspase-3 的活性主要归因于线粒体途径[49-51]。

4.3 炎症反应损伤线粒体

蒽环类药物可诱导促炎细胞因子IL-6 和TNF 的过度表达，引起心脏组织的炎症反应，导致心肌细胞内线粒体和细胞膜的氧化损伤，增加心脏毒性[52]。

5 线粒体能量代谢障碍

心脏高能磷酸盐代谢障碍，已被认为是蒽环类药物心脏毒性的一个重要特征。已提出的阿霉素诱导的心脏能量衰竭的机制包括线粒体氧化还原功能的改变、细胞内ATP 的降低，能量底物利用状况的改变，以及能量生产和消耗之间能量转移的干扰[53-57]。研究表明，临床相关的阿霉素引起的急性心功能不全也与心脏能量代谢受损有关。阿霉素引起的急性心脏毒性伴随NADPH氧化还原状态、线粒体膜电位和葡萄糖摄取的变化。许多实验结果也一致地表明阿霉素扰乱了心肌线粒体能量代谢。

最近有研究表明阿霉素在培养的心肌细胞中是NF-κB 的有效激活因子[58]，通过干扰素-γ介导心肌细胞信号导致线粒体呼吸和脂肪酸氧化的中断，也减少AMPK信号，从而导致能量代谢障碍[59]。有实验表明，阿霉素影响心肌的代谢功能可能是通过调控PPAR核受体。在啮齿动物中，阿霉素导致心肌组织中PPARα、PPARγ和PPARσ的下调，这些都被认为是对该药物代谢组反应的重要因素。PGC1α被认为在介导这一系列反应中起主要作用[60-64]。

阿霉素在进入线粒体的过程中使线粒体的NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶[65]、细胞色素还原酶及琥珀酸脱氢酶的活性降低，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成障碍，还严重影响了心肌的收缩和舒张。

ATP/ADP 和能荷（EC）是反映细胞能量水平和能量状况的重要参数。ATP/ADP和EC比值的降低不仅刺激了线粒体的氧化磷酸化，而且还导致自由能和线粒体膜电位的降低。

线粒体Ca2+蓄积可减少高能磷酸键生成，通过能量代谢机制进一步加重心肌细胞损伤。较多文献认为阿霉素及其代谢物降低了线粒体钙负荷的能力[19，48]。此外，心肌线粒体MPT 的诱导增强也可能是导致心肌线粒体呼吸频率降低的原因之一[66]。

6 小结与展望

通过对阿霉素心脏毒性机制的研究，降低阿霉素治疗癌症带来的副作用，对阿霉素的临床应用，癌症治疗和患者预后有十分重要的意义，也对未来研发更有效的蒽环类药物提供了理论基础。

（利益冲突：无）