新冠病毒核酸检测试剂盒的性能分析与评价

张小燕 高静贤 那成龙 赵鹏程

1 江苏省医疗器械检验所 （江苏 南京 210019）

2 南京世和医疗器械有限公司 （江苏 南京 210012）

内容提要： 目的：对4种新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能包括敏感性与特异性、最低检出限、精密度和分析特异性进行评价，为实验室选择新冠病毒核酸检测试剂盒提供参考，促进新冠肺炎病毒核酸检测技术的创新改进。方法：以20例新冠病毒确诊阳性和10例确诊阴性的咽拭子作为研究样本，经提取得到RNA后根据4种新冠病毒核酸检测试剂盒说明书对其进行检测，分析扩增结果，评估各试剂盒的差异。结果：检测结果显示4种试剂盒对30例研究样本的阴阳性判定情况不尽相同，其中a试剂盒的敏感性和特异性最高，均达到100%；3例阳性样本稀释到100倍时，c试剂盒只能检出其中的1例，而其他三种试剂盒能检出其中的2例，表明c试剂盒的检测敏感性低于其他三种；4种试剂盒在精密度实验中检测样本得到的Ct值的CV值都较接近，且都＜10%；加入了8种常见的高浓度干扰物质的临界阳性样本经4种试剂盒检测，结果依然为弱阳性，说明无干扰；4种试剂盒检测5例含非目标病毒的临床样本，检测结果为阴性，即未发生交叉反应。结论：新冠病毒核酸检测试剂盒对低浓度核酸样本的检测能力有所差异，各试剂盒不同的检出限也造成了总体上的敏感性和特异性的差异，实验室在选择新冠病毒核酸检测试剂盒时可以对其进行性能验证，以保证选到最合适的试剂盒。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV-2）为新型冠状病毒肺炎疫情的病原体，该病毒主要通过口鼻分泌物传播，包括咳嗽、打喷嚏和说话产生的呼吸道飞沫，感染该病毒者常见的症状包括发热、咳嗽、疲劳、呼吸急促、味嗅觉丧失[1-3]。SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约80～120nm，包含有核酸及核衣壳蛋白，有三种主要蛋白：包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和刺突蛋白（S蛋白）[4,5]。经研究，SARS-CoV-2感染机制是：在接触宿主细胞时，病毒的S蛋白会经历特定的构象变化，使之RBD区域暴露后与hACE2相结合，接着通过促进S2蛋白介导与细胞的膜融合完成感染的全过程[6-8]。

在国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》中规定，实时荧光PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）方法与基因组测序、新冠病毒特异性抗体检测同被作为诊断标准。而以RT-PCR方法作为检测技术的试剂盒是目前获得医疗器械注册证最多的新冠病毒检测产品，作为主流检测技术，RT-PCR相较于常规的抗原和抗体检测，具有灵敏度和特异度高、不存在窗口期且不易被干扰的优点；相较于宏基因组测序，具有操作简单、耗时短和花费低的优点。RT-PCR检测新冠病毒核酸试剂盒针对的位点是其基因组的3端保守基因序列，及RdRp基因（位于ORF1ab）、N基因和E基因。《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）》推荐对ORF1ab和N基因设计引物和探针进行检测。本文从产品的敏感性与特异性、最低检出限和精密度三个方面对市场份额占比较大的4种荧光定量PCR法核酸检测试剂盒进行分析与评价，以期为各实验室选择SARS-CoV-2检测试剂盒时提供参考。

1.资料与方法

1.1 一般资料

实验起止时间：2022年1月～2022年2月。

样本：收集20例新型冠状病毒确诊阳性患者（样本编号为YS-1至YS-20）与10例确诊阴性健康人的咽拭子（样本编号为YS-21至YS-30）作为本次研究的样本。

检测试剂：提取试剂选用QIAGEN生产的QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904），严格按照说明书进行提取。本研究中用到的4种试剂盒的信息见表1。

表1. 4种新型冠状病毒核酸检测试剂盒基本信息

检测仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

严格按照QIAamp Viral RNA Mini Kit的说明书对30例咽拭子提取后，使用Qubit 4.0测量核酸浓度，使用NanoDrop One紫外/可见分光光度计测量A260/A280比值。

1.2.2 敏感性与特异性

敏感性和特异性是在医学统计里评定一个诊断指标时最基本的两个特征，敏感性即在金标准判断阳性人群中，检测出阳性的概率，是代表真阳性率，敏感性越高意味着此种检测方法的漏检率越低；特异性即在金标准判断阴性人群中，检测出阴性的概率，是代表真阴性率，特异性越高意味着此种检测方法的误诊率越低。严格按照4种试剂盒的说明书对20例新型冠状病毒确诊阳性患者与10例确诊阴性健康人的咽拭子提取的RNA进行检测，记录各个样本的Ct值，从而进行敏感性与特异性的计算。

1.2.3 最低检测限

最低检出限是指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量，代表着此种方法的灵敏度。根据检测的Ct值，选取3例不同阳性水平的样本，分别进行5倍、10倍、50倍和100倍稀释（样本编号1-5代表1号样本稀释5倍，以此类推），再用各个试剂盒对其进行检测，记录结果比较各试剂盒的最低检出限。

1.2.4 精密度

精密度用来表示检测的再现性，可用来衡量体外诊断试剂批内与批间、日内与日间、室内与室间等的变异程度。根据检出限研究的检测结果，使用健康人提取的RNA与新冠病毒确诊阳性的患者RNA混合配制成中阳性水平样品1例[编号为M（1）～M（16）]，弱阳性水平样品[编号为L（1）～L（16）]1例，再将几例阴性RNA混合成阴性样品[编号为N（1）～N（16）]1例，用三批试剂进行批内、批间、日间、人间、室间的精密度比较研究。安排两个实验员使用三批次试剂在两个实验室完成，每例样本总共重复16次。

1.2.5 干扰研究

根据这些试剂盒所检测样本类型，针对可能存在的内源性和外源性干扰物质进行验证，具体干扰物质及其浓度见表2。本实验采用弱阳性水平样本[样本编号为L（1）～L（8）]，将每种干扰物质添加到样本中使其成为潜在最大浓度，然后在此条件下进行评价，见表2。

表2. 干扰物质列表

1.2.6 交叉反应

搜集含非目标病毒但不含甲型流感病毒的临床样本，使用4种试剂盒进行检测，考察目标病毒（新型冠状病毒）的检测结果是否符合预期。总共收集了5例样本，各样本所含病毒信息见表3。

表3. 交叉反应用样本信息表

2.结果

2.1 敏感性、特异性

由表4可见，各试剂盒分别能检出阳性样本例数18～20例不等，导致敏感性为90%～100%不等，可见各试剂盒的敏感性差异不大，且均在90%以上。

表4. 用4种试剂盒检测的20例咽拭子阳性样本敏感性结果

由表5可见，在总共10例阴性样本中，各试剂盒检出阴性个数均为10例，特异性都较好。

表5. 用4种试剂盒检测的10例咽拭子阴性样本特异性结果

2.2 检出限

将3例不同阳性水平的样本分别稀释后，用4种试剂盒进行检测得到结果见图1，结果显示a试剂盒的检出限最低，灵敏度最高，反之，c试剂盒的检出限最高，灵敏度最低。

图1. 用4种试剂盒检测不同阳性水平样本的结果（Ct值）

2.3 精密度

为了比较这4种试剂盒在批内与批间、日内与日间、人间、室间的精密度，安排了2名实验员对3例样本，每例样本共计16次的重复性实验，得到实验结果见图2、表6。可见不同试剂盒在6个方面的重复性的变异系数（CV%）有较大差异。

图2. 精密度实验结果

表6. 变异系数-阴性样本(CV%)

2.4 干扰研究

采用总共2种内源性和6种常见外源性干扰物质对弱阳性水平临床样本进行干扰研究，结果（图3）显示，这8种干扰物质在较高浓度下对4种试剂盒的检测结果均无干扰。

图3. 干扰研究结果

2.5 交叉反应

4种试剂盒检测5例含非目标病毒但不含SARS-CoV-2的临床样本，结果均为阴性（-）。交叉反应结果见表7。

表7. 交叉反应结果

3.讨论

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎仍在全球流行，快速准确地诊断新冠病毒感染是这场疫情防控的关键。核酸检测是SARS-CoV-2诊断的最主要方法，发挥着难以取代的作用，而实时荧光（RT-PCR）方法检测新冠病毒的试剂盒是目前市场上最主流的产品，不同试剂盒之间的性能存在差异，决定了对样本的检出率和漏检率的不同，因此性能验证对实验室选择试剂盒显得尤为重要。

在本研究中，对临床上使用最多的荧光定量PCR法SARS-CoV-2核酸检测试剂盒产品进行了性能比较，包含了敏感性与特异性、精密度、最低检出限和分析特异性4个关键指标。4种试剂盒的敏感性从90%～100%不等，结合最低检出限验证实验的结果，可以得出造成敏感性不同的主要原因就是各试剂盒对低病毒载量样本的检测能力不同。总体来看，这4种试剂盒的检出结果与临床诊断结果接近，可以满足临床的使用需求，具有较高的临床适应性。