不同碳链长度离子液体对模式植物拟南芥和小麦的光合致毒效应

奚豪，李哲，方治国，刘惠君

浙江工商大学环境科学与工程学院，杭州 310018

离子液体（ionic liquids, ILs）是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成在低于100 ℃的温度下以熔融状态存在的有机盐。由于其具有低蒸发、低易燃性和高热稳定性等特点，被作为传统挥发性有机化学品的替代品广泛应用于液液分离、萃取和医药等领域[1]。鉴于ILs不断扩大的应用及其残留的持久性，其生态毒性效应受到关注，关于ILs对大型蚤、斑马鱼和藻类的毒性效应已经证实了其潜在的生态毒性，毒性作用取决于其结构和受试生物体[2-5]。研究表明，ILs对土壤污染也不容忽视，且会对蚯蚓、土壤微生物群落等产生影响[2, 6]，目前关于ILs对植物毒性的研究包括对浮萍、水稻、萝卜和玉米等种子萌发、植株生长、氧化胁迫和光合色素含量变化的影响等[7-8]，但对于不同植物类型的毒性差异少有涉及，而拟南芥和小麦是分别是理想的双子叶和单子叶模式生物。

本文研究3种ILs对拟南芥和小麦生长抑制（表型、叶质量）和光合作用（叶绿素含量、荧光成像和叶绿素荧光参数）的影响，解析不同碳链长度ILs的毒性差异以及不同植物的响应效应，研究结果可为合理开发和使用环境友好型ILs提供理论支持，为ILs的环境安全性评价提供理论依据。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 植物幼苗培养及处理

拟南芥（哥伦比亚野生型，Arabidopsisthaliana, Col）和小麦（TriticumaestivumL.）种子消毒春化后于培养液中光照培养箱培育，7 d后分别选取长势良好的幼苗，加入不同浓度ILs进行培养（25.0 ℃，光暗比为16 h∶8 h，光照40～70 μmol·m-2·s-1）。

1.2 ILs对植物幼苗的生长抑制

植物生长抑制实验根据OECD化学品测试指南，测定不同处理下7 d后的植物茎叶质量，每个处理组设置3个平行。

1.3 植物叶绿素含量的测定

使用SPAD-502叶绿素含量测定仪，根据植物叶片在2种波长（650 nm和940 nm）下的光学浓度差，测定植物叶片相对叶绿素含量。

1.4 植物叶绿素荧光参数测定

植物叶片暗处理20 min后，参考Lefebvre等[9]的研究，在光化光的光强度分别为0、1、36、81、144、256、361、484、625和841 μmol·m-2·s-1时，用叶绿素荧光仪测量最小荧光（F0）、最大荧光产量（Fm）、最大光化学量子产量（Fv/Fm）、实际光化学量子产量（Y（Ⅱ））和PSⅡ调节性能量耗散的量子产量（Y（NPQ）），并绘制快速光响应曲线。

1.5 数据统计与分析

实验数据用Microsoft Excel 2019和Origin 2019进行处理，用SPSS 26进行单因素方差分析（ANOVA），用Tukey法进行显著性检验，数据结果均采用means±SD的形式表示。

2 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 ILs对植物幼苗的生长抑制

在3种不同碳链长度ILs暴露处理7 d后，拟南芥叶片颜色和叶片大小均发生变化，与对照组叶片相比，ILs处理组的叶片均明显变小（图1）。在[C6mim]NO3和[C8mim]NO3处理组，拟南芥主叶脉白化，叶片出现褪绿黄化（图1（a）和1（b））；在0.5 mg·L-1[C12mim]NO3处理组叶片出现褐色，高浓度下叶片部分坏死（图1（c））。选择毒性胁迫较大的[C12mim]NO3处理小麦，根长和叶片大小随ILs浓度升高而缩短或缩小（图1（d））。

ILs对植物茎叶质量有明显抑制作用（表1），表现为明显的剂量-效应关系。暴露于[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3相同处理浓度（2 mg·L-1）下，拟南芥的茎叶质量分别为对照组的63.64%、35.82%和9.09%，说明ILs对拟南芥毒性作用为[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3，其毒性随碳链长度增加而增大。[C12mim]NO3处理组对拟南芥和小麦的EC50分别为0.167 mg·L-1和1.13 mg·L-1。小麦受到的胁迫比拟南芥轻，说明小麦和拟南芥对ILs的敏感性存在差异。

2.2 ILs对植物光合作用的影响

2.2.1 ILs对植物叶绿素含量的影响

ILs处理后，拟南芥叶绿素含量随ILs浓度增加明显减少（表1）。2 mg·L-1[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3处理组的叶绿素含量分别为对照组的81.25%、53.13%和15.63%，说明碳链越长其毒性越强。以往的研究也发现拟南芥和藻类的叶绿素含量随ILs碳链长度增加而降低[10]。

[C6mim]NO3和[C8mim]NO3处理下拟南芥幼苗的新叶与老叶的叶绿素含量均明显降低；在[C12mim]NO3处理组，老叶叶绿素含量下降，而其新叶叶绿素含量却呈升高趋势，0.5 mg·L-1[C12mim]NO3处理组的新生叶片叶绿素含量为对照组的140%，而老叶只有对照组的48.20%。即[C12mim]NO3的新生叶片的生长状态比老叶更好，这可能是植物在暴露于过强的毒性胁迫时的一种自我防御。面对环境胁迫时植物优先将营养集中调往新生叶片，舍弃老旧枯萎叶片而保证植株新生部分存活[11]。小麦叶片叶绿素含量随ILs浓度增加而降低（表1），2 mg·L-1浓度处理下小麦叶片叶绿素含量为对照组的91.43%，拟南芥叶片仅为15.26%，这说明小麦的叶绿素减少量更小，这与茎叶质量变化规律一致。

图1 3种离子液体（ILs）处理后植物幼苗形态学的变化注：（a）～（c）拟南芥；（d）小麦。Fig. 1 The morphological changes of plant seedlings after three ionic liquids （ILs） treatmentsNote: （a）～（c） Arabidopsis thaliana; （b） Triticum aestivum L..

表1 ILs对植物生长及叶绿素含量的影响Table 1 The effect of ILs on plant growth and chlorophyll content

2.2.2 ILs对植物叶绿素荧光参数的影响

测定叶绿素荧光可以得到光合作用的过程信息[12]，不同浓度ILs处理下植物幼苗叶绿素荧光参数如表2所示，包括最小荧光（F0，与叶片叶绿素浓度有关）、最大荧光产量（Fm，反映经过PSⅡ的电子传递情况）和最大光化学量子产量（Fv/Fm，反映PSⅡ反应中心的光能转换效率，不受物种生长阶段影响，非胁迫条件下变化极小，胁迫环境下表现为下降）[13]。

在2 mg·L-1[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3处理组，老叶的F0值分别为对照组的1.07倍、1.23倍和2.23倍，说明碳链长度越长，对叶片光能效率影响越大。[C6mim]NO3和[C8mim]NO3处理组，新叶和老叶的F0均随ILs浓度增加而升高，这可能是由于植物的电子传递通路被切断，植物受到的氧化损伤增加，使得PSⅡ发生光失活，导致其反应中心流失，光合系统受到抑制而使F0上升[14]；Fm均随ILs浓度增加而降低，表明光系统Ⅱ受到胁迫，导致其类囊体膜受损或类囊体失去活性，影响植物吸收光能的效率[15]；新叶和老叶Fv/Fm随ILs浓度增加而下降，表明叶片中的光抑制以及开放PSⅡ中心活性下调。而[C12mim]NO3处理下拟南芥叶片的荧光参数变化不同，老叶F0随ILs浓度增加而增加，而新叶F0随ILs浓度增加而下降，新叶中Fv/Fm变化较小，而在老叶中显著下降，仅为对照的11.89%，说明老叶受到较强胁迫，但新叶叶片吸收光能效率反而增加，这与叶绿素含量的结果一致。

表2 3种ILs处理下植物叶片的荧光参数Table 2 Fluorescence parameters of plant leaves under three ILs treatments

随ILs浓度增加小麦叶片F0升高、Fm降低，Fv/Fm降低，说明小麦的光合作用过程受到胁迫。在相同浓度处理下（2 mg·L-1），小麦叶片和拟南芥叶片的F0值分别为对照组的125.00%和222.47%，Fm值分别为对照组的82.91%和73.22%，说明ILs对小麦光合作用的影响小于拟南芥。

相关性分析表明，光合作用参数与生长抑制率具有较好的相关性，[C6mim]NO3处理下拟南芥幼苗的新叶和老叶叶绿素含量与抑制率的相关系数（r2）分别为0.9496和0.8906，[C8mim]NO3和[C12mim]NO3处理下新叶与老叶叶绿素含量与抑制率的r2分别为0.9965和0.6365、0.6476和0.7418；[C12mim]NO3处理下小麦叶片叶绿素含量和Fv/Fm与抑制率的r2分别为0.8117和0.8643，说明ILs可能通过抑制植物光合作用而影响植物生长[16]。

2.3 ILs对植物荧光外观的影响

光合图谱颜色代表了Fv/Fm的值，图片下方的色带从左到右（从橙色到蓝色）为Fv/Fm值增大。而Fv/Fm的值越小表示植物受到的胁迫越大（图2）。

在[C6mim]NO3处理组中，随ILs浓度升高（10 mg·L-1以上），拟南芥叶片的荧光图颜色从纯蓝色转变为叶片中心出现绿色，ILs对拟南芥造成光合胁迫；在[C8mim]NO3处理组中，随ILs浓度升高（1 mg·L-1以上），荧光成像图颜色由纯蓝色转变为叶片大范围出现绿色，拟南芥受到光合胁迫，且[C8mim]NO3对拟南芥的光合胁迫比[C6mim]NO3更强；[C12mim]NO3处理组中，随ILs浓度升高（1 mg·L-1以上），叶片图像甚至开始出现橙色，少数叶片出现枯萎破损。在同一浓度处理下（2 mg·L-1），[C12mim]NO3造成的光合胁迫（橙黄色）比[C8mim]NO3（绿色）和[C6mim]NO3（蓝色）更强，因此进一步说明3种供试ILs的毒性大小为：[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3（图2（a））。

在0.5 mg·L-1和1 mg·L-1[C12mim]NO3浓度下，小麦叶尖呈现少量绿色，2 mg·L-1处理叶尖有少量橙色出现（图2（b）），而在同一浓度下的拟南芥叶片已完全转为橙绿色。这说明ILs对小麦存在光合胁迫，但胁迫的程度小于拟南芥。

2.4 ILs对植物Y（Ⅱ）和Y（NPQ）的影响

为了进一步明晰ILs胁迫下PSⅡ系统变化，测定了植物叶片Y（Ⅱ）和Y（NPQ）[17]。Y（Ⅱ）反映的是叶片的实际光能转化效率，表示PSⅡ的实际光合效率[18]，Y（NPQ）是指非光化学猝灭量子产率，指PSⅡ调节性能量耗散（如将过量光能耗散为热）的量子产率[19]。

随ILs浓度增高，拟南芥叶片Y（Ⅱ）下降（图3（a）），说明拟南芥的实际光合效率下降，这可能与PSⅡ的光捕获复合体破坏有关。光捕获复合体是光系统Ⅰ和光系统Ⅱ之间的结构，其作用是维持2个光系统的能量平衡，而有毒物质会破坏这种平衡，从而影响光合作用[20]。在同等条件（36 μmol·m-2·s-1，2 mg·L-1）下，[C6mim]NO3和[C8mim]NO3处理组的Y（Ⅱ）值分别为对照组的98.96%和25.13%，说明[C8mim]NO3对拟南芥的胁迫更强。[C12mim]NO3处理组的Y（Ⅱ）值差别不大，说明该组植物样品受到胁迫较小，这可能由于植物受高毒性污染物胁迫时，会产生某种自我防御[21]。

图2 ILs处理后植物叶片叶绿素荧光图注：（a）拟南芥；（b）小麦。Fig. 2 Chlorophyll fluorescence of plant leaves treated with three ILsNote: （a） Arabidopsis thaliana; （b） Triticum aestivum L..

图3 ILs对植物Y（Ⅱ）和Y（NPQ）的影响注：（a）和（b）拟南芥；（c）和（d）小麦；PAR表示光合有效辐射，Y（Ⅱ）表示实际光合效率，Y（NPQ）表示非光化学猝灭量子产率。Fig. 3 The effect of ILs on plant Y （Ⅱ） and Y（NPQ）Note: （a） and （b） Arabidopsis thaliana; （c） and （d） Triticum aestivum L.; PAR means photosynthetically active radiation; Y（Ⅱ） means effective photosynthetic efficiency; Y（NPQ） means non photochemical quenching quantum yield.

拟南芥的Y（NPQ）值随[C6mim]NO3和[C8mim]NO3浓度升高而降低（图3（b）），Y（NPQ）下降说明叶绿素a对电子的传导率降低，影响PSⅡ正常运作，从而影响植物的正常光合作用[22]。在36 μmol·m-2·s-1光强和2 mg·L-1浓度下，[C6mim]NO3、[C8mim]NO3和[C12mim]NO3处理组的Y（NPQ）分别是对照组的95.37%、81.91%和116.30%。[C8mim]NO3处理组的Y（NPQ）值比[C6mim]NO3低，说明[C8mim]NO3毒性更强；而[C12mim]NO3处理组的Y（NPQ）却比对照组高，说明拟南芥受到的胁迫较小，可能是植物在面对高毒性污染物时产生的某种自我防御。

在[C12mim]NO3处理下，小麦叶片的Y（Ⅱ）值和Y（NPQ）与对照没有显著差异（图3（c）和3（d）），说明[C12mim]NO3对小麦叶片实际光合效率和电子的传导率影响不大。

本文研究了3种不同碳链长度咪唑硝酸盐ILs对拟南芥和小麦的生长抑制作用，其毒性大小为[C12mim]NO3>[C8mim]NO3>[C6mim]NO3。3种供试ILs对拟南芥和小麦叶片的叶绿素含量均有明显影响，叶绿素合成受到严重抑制，且ILs的碳链长度越长，拟南芥幼苗受到的光合胁迫越强。[C6mim]NO3和[C8mim]NO3处理组及[C12mim]NO3处理组老叶的拟南芥叶片荧光参数F0随ILs浓度增加而升高，Fm、Fv/Fm、Y（Ⅱ）和Y（NPQ）随ILs浓度增加而下降，说明ILs可以通过破坏PSⅡ的光捕获复合体和降低光合作用电子传导率来影响光能转化效率和PSⅡ的正常运作，进而影响植物正常光合作用。而[C12mim]NO3处理下拟南芥新叶叶绿素含量上升，F0下降，Fm、Fv/Fm、Y（Ⅱ）和Y（NPQ）升高，说明植物受到高毒性污染物胁迫时，会产生某种自我防御。[C12mim]NO3对小麦的光合作用影响要小于拟南芥，因此研究ILs毒性时应考虑不同植物类型的毒性效应。