胶原蛋白肽复合银耳多糖对D-半乳糖致衰小鼠的改善作用

徐晓飞，赵明月，钟兴伟，何瑞琪

（1 广东海洋大学食品科学与工程学院 广东阳江 529599 2 华南协同创新研究院 广东东莞 523808 3 几何细胞生物研究中心 广东东莞 523808）

皮肤中胶原蛋白分布于真皮层，含量约为70%，主要为I 型胶原蛋白（85%），其网状结构为真皮提供了支撑和保护[1]。胶原蛋白可被基质金属蛋白酶（Matrix metallo-proteinase，MMPs）降解，紫外线和自由基会使胶原蛋白变性，美拉德反应使糖类和胶原蛋白发生反应形成糖基化产物，在皮肤中表现为纹路紊乱、发黄和失去弹性等衰老表现[2]。胶原蛋白降解成胶原蛋白肽，分子质量范围从数百到上万道尔顿不等。在体外试验中，胶原蛋白肽对多种自由基具有清除作用[3-4]。在动物实验中，补充的胶原蛋白水解物通过抑制MMP2 酶活性来提高皮肤胶原蛋白含量[5]，以及提高机体抗氧化酶系统活性，如超谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT），以降低皮肤光老化损伤[6]。在2 项随机双盲、安慰剂对照设计考察补充胶原蛋白肽作用的研究中，年龄介于35～65 岁的女性人群日常补充胶原蛋白肽，能改善皮肤健康状态，如增加弹性和水分，提高I 型胶原蛋白原和弹性蛋白含量，减少皱纹[7-8]。这些生理功能特性，使胶原蛋白肽成为广泛使用的美容功能原料，以及日常保健抵抗皮肤老化的手段。在美容功能食品中，胶原蛋白肽常与其它成分，如果汁、中药、透明质酸等，配伍使用[9-11]，其目的包括增强美容效果，使功效面更广或产品差异化。

银耳（Tremella fuciformis Berk.）又称白木耳、雪耳，是一种高等大型食用真菌。中医认为银耳具有滋阴润肺、益气和血的作用，是公认具有美容养颜作用、有悠久食用历史的食材。银耳多糖（T.fuciformis polysaccharides）是银耳中含量丰富的活性成分，研究表明银耳多糖具有免疫调节与抗肿瘤，抗氧化和抗衰老，神经细胞保护等多种活性[12]。因其来源天然、活性突出，故银耳多糖在功能性食品领域具有广阔的应用前景[13]。

胶原蛋白肽和银耳多糖为大众熟知、功效突出的美容抗衰老食品原料。然而，两者配伍的功效研究却少见。基于此，本文将2 种成分按一定比例复合，研究其对D-半乳糖致衰老小鼠模型皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量，组织中氧化应激压力和炎症因子水平的影响，并分析肠道SCFAs 变化，探索可能作用机理，为银耳多糖和胶原蛋白肽配伍用于美容抗衰老功能性食品提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 体质量（18±2）g、4 周龄的SPF级昆明雄性小鼠，采购自广东省医学实验动物中心[合格证号SCXK（粤）2018-0002]。

1.1.2 试剂 胶原蛋白肽 （型号PEPTIPLUS XB），嘉莉达明胶有限公司；银耳多糖（平均分子质量500 ku），博士生物科技（广州）有限公司；D-半乳糖（99%）、乙酸（99.8%）、丙酸（99.5%）、异丁酸（99.5%）、丁酸（99.5%）、异戊酸（99%）、戊酸（99%），上海麦克林公司；SOD、GSH-Px、MDA（Malondialdehyde）测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；小鼠透明质酸、羟脯氨酸、IL-1β、TNF-α 试剂盒（ELISA 法），江苏酶免实业有限公司，磷酸盐（PBS）缓冲液，Gibco 公司；二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、RIPA 裂解液，北京康为世纪生物科技有限公司；其它试剂为国产分析纯级。

1.2 仪器和设备

高速冷冻离心机（型号SIGMA3-18K），德国SIGMA 公司；酶标仪（型号ELx800），美国BioTek公司；中低通量组织研磨器 （型号TissueLyser LT），德国QIAGEN；气相色谱仪 （型号GC-2010PLUS），岛津仪器公司；毛细管色谱柱（型号DB-FATWAX），安捷伦仪器公司；pH 计 （型号Five Easy Plus），瑞士梅特勒；恒温水浴箱，富华仪器有限公司；电子天平（型号BS224S），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物实验方法 动物在SPF 实验室（GB 14925-2010）：室温（22±2）℃、60～80%RH、12 h 光/暗循环（许可证编号为SYXK（粤）2018-0085）。实验程序符合中国有关实验动物使用和护理的法规，实验伦理经广州中医药大学伦理委员会批准。小鼠摄入标准饲料、自由饮水，适应SPF 环境2 周后，32 只小鼠随机分4 组：正常组（Normal，n=8）灌胃生理盐水，模型组（Model，n=8）灌胃生理盐水，胶原蛋白肽组（CP，n=8）灌胃胶原蛋白肽剂量830 mg/（kg·d），胶原蛋白组复合银耳多糖组（Collagen peptide combined with TFPs，CPTP）灌胃剂量：胶原蛋白肽830 mg/（kg·d）+银耳多糖100 mg/（kg·d），n=8。Model 组、CP 组和CPTP 组每天上午腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg[14-15]，Normal 组腹腔注射生理盐水；实验组每天下午灌胃实验样品，Model组及Normal 组灌胃生理盐水。实验持续8 周。最后一次灌胃样品后，小鼠禁食12 h、自由饮水。第2 天麻醉后眼眶取血，在4 ℃下5 000×g 离心15 min 获得血清。最后安乐死处死小鼠，小鼠背侧部脱毛后，取皮肤组织约1 cm2（避免带入白色脂肪组织），放入液氮中速冻；快速剖取心、肝组织用预冷的PBS 漂洗去除血液，然后放入液氮中速冻；在冰上收集小肠和结肠内容物，放入液氮中速冻。所有样品-80 ℃保存，在2 个月内完成检测。

取血清样本按SOD、GSH-Px、MDA 试剂盒和小鼠IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒操作说明分别测定相应指标。

取小鼠肝、心脏组织用组织匀浆器加4 ℃PBS 制备成10%匀浆液，4 ℃下以5 000×g 离心15 min 取上清，用蛋白定量试剂盒进行定量，再分别按照试剂盒操作说明测定上清液中SOD、GSH-Px活力和MDA 浓度[15]。

取小块小鼠皮肤组织用丙酮-乙醚（1∶1）脱除脂肪、切碎、晾干，然后精密称取20 mg，按小鼠透明质酸、羟脯氨酸试剂盒操作说明测定样本中羟脯氨酸和透明质酸水平[15]。

1.3.2 小肠、结肠内容物pH 检测 用超纯水分别将解冻后的小肠、结肠内容物以质量比1∶1 稀释，然后用pH 计测定[15-16]。

1.3.3 小肠、结肠内容物中SCFAs 测定 参考文献[15]和[17]报道方法，用1.5 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将100 mg 肠道内容物均质，并于5 000×g离心10 min，取1 mL 上清液添加0.5 mL 体积分数50%的硫酸酸化，随后加入2 mL 乙醚进行有机萃取，在5 000×g 下离心5 min，取上清液过0.22 μm 滤膜后注入气相色谱仪。色谱柱为DB-FATWAX 毛细管柱（30 m）。气相色谱设置：初始温度120 ℃，保持2 min，5 ℃/min 升至140 ℃保持3 min，然后10 ℃/min 升至170 ℃保持5 min；进样口250 ℃，检测器250 ℃，分流比25 ∶1，高纯氦气（99.99%）设定流量为1.8 mL/min。乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸标准品用超纯水分别制备标准品溶液，同法测定。

1.4 数据处理

数据以“平均值±标准差”表示。组间比较采用one-way ANOVA 和Tukey 检验，采用SPSS 20.0进行统计学分析，P ＜0.05 表示差异显著，P ＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 对小鼠一般体征的影响

在整个实验期间，各组小鼠摄食、日常活动正常，各半乳糖注射组的小鼠皮毛光泽相比Normal组小鼠较差，而CP 组和CPTP 组小鼠皮毛光泽比Model 组小鼠好。在8 周内，各组小鼠体质量缓慢增加，组间体质量无明显差别（P ＞0.05），表明造模药物和样品对小鼠机能无明显副作用（图1）。

图1 实验期间各组小鼠体质量的变化Fig.1 Changes in body weight during the period of experiment

2.2 对小鼠皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量的影响

连续8 周D-半乳糖处理极显著降低了Model组小鼠皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量（P＜0.01）（见图2），加速了皮肤衰老，而CP、CPTP 灌胃后极显著提高了模型小鼠老化皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量 （CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01）。特别地，CPTP 组小鼠皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量极显著高于CP 组 （CPTP vs.CP，P＜0.01），表明胶原蛋白肽复配银耳多糖后抗皮肤衰老活性明显提升（图2）。

图2 实验样品对小鼠皮肤羟脯氨酸（a）和透明质酸（b）含量的影响Fig.2 Influences of experiment samples on the contents of hydroxyproline （a） and hyaluronic acid （b） in skin

2.3 对组织中GSH-Px、SOD 活性和MDA 含量的影响

如图3所示，与Normal 组相比，Model 组的GSH-Px 和SOD 活力极显著降低，而MDA 极显著增加（P＜0.01）（在血清、肝脏、心脏组织），进一步证明D-半乳糖处理后衰老小鼠造模成功。显然，CP 组、CPTP 组则可以明显提高衰老小鼠体内GSH-Px 活性（CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01），而两者作用效果无差异（图3a）。同样地，CP组和CPTP 组能极明显提高衰老小鼠各组织中SOD 活力（P＜0.01）；然而在肝脏、心脏组织中，CPTP 组的SOD 活力却比CP 组更低（P＜0.01）（图3b）。对脂质过氧化物MDA 浓度的比较，CP 组和CPTP 组的组织中MDA 浓度均比Model 组极显著降低（P＜0.01），与组织中GSH-Px、SOD 活力上升结相吻合；在肝脏部位，CPTP 组的MDA 浓度比CP 组更低（P＜0.05）。

图3 实验样品对血清、肝脏、心脏组织氧化压力的影响Fig.3 Influences of experiment samples on oxidative stress in serum，liver，and heart tissues in mice

2.4 对IL-1β 和TNF-α 浓度的影响

由图4可知，相比Normal 组小鼠，Model 组小鼠炎性细胞因子IL-1β、TNF-α 水平极显著上升（P＜0.01），表明Model 组小鼠体内有高水平炎症。CP 组和CPTP 组灌胃处理明显降低了小鼠血清中IL-1β、TNF-α 浓度 （CP vs.Model，CPTP vs.Model，P＜0.01）；特别地，相比CP 组，CPTP 组的IL-1β、TNF-α 浓度更低（P＜0.01），表明CPTP 组对炎性细胞因子分泌抑制作用比CP 组强（图4）。

图4 实验样品对小鼠IL-1β、TNF-α 含量的影响Fig.4 Influences of experiment samples on the contents of IL-1β，TNF-α in serum in mice

2.5 小鼠肠道pH 值和SCFAs 的变化

pH 值表明小鼠小肠环境内呈弱碱性，且各组小肠内pH 值无明显差别（图5）；在结肠内则表现为弱酸性（pH＜7），Model 组小鼠结肠内pH 值显著低于Normal 组小鼠（P＜0.01），而CP 组、CPTP 组小鼠极显著高于Model 组小鼠（P＜0.01），表明CP组、CPTP 组能提高衰老小鼠结肠内pH 值。进一步利用气相色谱检测肠道中6 种主要SCFAs 的浓度，在小肠内没有检出SCFAs，在结肠内乙酸和丙酸是主要的SCFAs，其次是正丁酸，而异丁酸、正戊酸、异戊酸浓度均较低（图6）。在总SCFAs 方面，Model 组小鼠总SCFAs 浓度显著升高（Model vs.Normal，P＜0.05），这个结果与Model 组在结肠内低pH 值的趋势吻合；而CP 组、CPTP 组总SCFAs 与Model 组并无明显差异。与Normal 组比较，Model 组异丁酸含量明显升高（P＜0.01），而其余5种SCFAs 含量无明显差异（图6）。与Model 组比较，CP 组乙酸浓度提高（P＜0.05），提示胶原蛋白肽能增加衰老小鼠结肠内乙酸浓度，而其余SCFAs 浓度各组间并无明显差别（图6），这些结果提示CP 组、CPTP 组对结肠内SCFAs 浓度无明显调节作用。

图5 实验样品对小肠和结肠pH 值的影响Fig.5 Influences of experiment samples on pH value in small intestine and colon in mice

图6 实验样品对结肠总SCFAs（a）和6 种SCFAs（b）含量的影响Fig.6 Influences of experiment samples on the contents of total SCFAs （a） and six subtypes of SCFAs （b） in colon in mice

3 讨论

在本研究中，利用D-半乳糖致衰小鼠模型，发现胶原蛋白肽复合银耳多糖对小鼠衰老皮肤中羟脯氨酸（胶原蛋白特征氨基酸）和透明质酸含量改善作用优于胶原蛋白肽，同时可明显提高机体的抗氧化能力，降低机体炎症水平，表明胶原蛋白肽复合银耳多糖后，具有明显抗衰老活性优势。

衰老是自然界中生物遵循的普遍规律。在机体衰老进程中，机体抗氧化系统能力下降（包括抗氧化酶和抗氧化物质），从而对ROS（Reactive oxygen species）清除能力降低，造成ROS 在细胞内堆积，损害细胞结构完整和功能发挥，并进一步加速衰老[18]。人体衰老伴随皮肤胶原蛋白和透明质酸含量的下降[19-20]。胶原蛋白肽具有良好的ROS 清除作用[21]，以及通过抑制内源性抗氧化酶的耗竭，表现出抗氧化活性[22]。同时，人体临床研究发现口服胶原蛋白肽能提高皮肤胶原蛋白原的含量[8]。这些研究报道与本实验结果一致。此外，已有研究表明银耳多糖可提高衰老小鼠体内抗氧化酶，如SOD、GSH-Px 的活力，增加衰老皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量[14]。在本研究中，对D-半乳糖致衰老小鼠模型皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量检测结果表明，CPTP 对衰老皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量提升作用明显优于单一胶原蛋白肽，表明胶原蛋白肽复配银耳多糖可能具有一定协同作用，值得进一步深入研究。相比胶原蛋白肽，胶原蛋白肽复合银耳多糖对机体中GSH-Px 活力并没有进一步提升，甚至反而使得SOD 活力出现下降现象，一方面表明CPTP 组小鼠体内的ROS 积累水平可能低于CP 组，另一方面也提示实验组小鼠衰老皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量的增加并非是提升机体抗氧化能力的单独作用。

除ROS 过量积累外，慢性炎症也是加速机体衰老的元凶之一，衰老机体伴随着高水平的炎性细胞因子[23]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类受Zn2+、Ca2+调控的蛋白水解酶，MMPs 具有降解细胞外基质所有成分，如胶原、黏性蛋白、纤维黏连蛋白等的能力[24]。机体在炎症状态下，MMPs 活性增加[24]，造成胞外基质降解增加。在D-半乳糖所致衰老小鼠模型中，炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平显著增加，表明衰老模型小鼠处于炎症状态。在本实验中，胶原蛋白肽表现出一定的抗炎活性，作用机理可能与其调控细胞内信号抑制NF-κB 的表达有关[22]。当胶原蛋白肽复合银耳多糖后，衰老小鼠体内炎性细胞因子水平大大降低，证明实验复合物抗炎效果优于单一胶原蛋白肽。据报道，在体外实验中，发现银耳多糖可抑制NF-κB 信号通路和miR155 转录，从而降低LPS 处理的RAW264.7免疫细胞内ROS 水平和抑制炎性细胞因子分泌[25]。由此提示，CPTP 可以通过多种方式发挥抗衰老（降低氧化压力，抑制炎症，提高免疫功能等）作用，从而有利于提升衰老皮肤中胶原蛋白和透明质酸含量。

在衰老模型小鼠肠道中，结肠部位pH 值下降、SCFAs 浓度增加。然而，有研究报道，与成年人相比，老年人肠道中SCFAs 浓度降低[26]，提示D-半乳糖所致衰老小鼠模型并不能完全模拟自然衰老状态。虽然胶原蛋白肽能增加模型小鼠肠道中乙酸浓度，但胶原蛋白肽和银耳多糖对模型小鼠肠道中其它类型SCFAs 和总SCFAs 浓度并没有明显影响，表明胶原蛋白肽复合银耳多糖可能通过非依赖SCFAs 途径，提高衰老小鼠抗氧化酶活性和发挥抗炎作用。尽管有许多研究指出非消化性多糖经肠道菌群代谢产生的SCFAs 能调控免疫细胞发育、分化和免疫功能响应，以及抑制组蛋白脱乙酰酶活（Histone deacetylases）而调节细胞转录因子表达[27]。原因可能在于本实验所使用的银耳多糖剂量太低，仅100 mg/（kg·d）。有学者报道，杏鲍菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharide）在400 mg/（kg·d）及以上剂量时，才能明显提高肠道中SCFAs 的浓度[28]。因此，胶原蛋白肽复合银耳多糖提高组织抗氧化酶活性的分子机理需要进一步研究。

4 结论

利用D-半乳糖致衰小鼠模型，发现相比单一CP，CPTP 能更有效提高模型小鼠衰老皮肤中羟脯氨酸和透明质酸含量，其作用机理可能是通过非SCFAs 依赖途径，保护机体抗氧化酶活性和抑制炎性因子表达作用而实现。本研究为胶原蛋白肽配伍银耳多糖应用于美容和抗氧化功能性食品，提供数据支撑。