一种脾虚肌萎证小鼠模型的复制与评价❋

钱 梦，朱巳旲，史 拓，李文飞，谢 鸣

(北京中医药大学中医学院，北京 100029)

“脾主肌肉”是中医脾脏重要的生理功能之一。脾虚肌无力是指脾虚无力运化、肌肉失于充养导致四肢无力、肌肉功能与质量出现明显的降低与损伤。脾虚肌萎(肌无力)动物模型的成功复制对于探查中医脾主肌肉的现代内涵及相关方药的作用机制具有重要意义。

目前有关中医脾虚涉及肌无力动物模型的制作方法主要有苦寒泻下法[1]、过劳+睡眠剥夺法[2]、过劳+饮食不节法[3，4]以及苦寒泻下+过劳+饮食失节法[5]4种，其中小鼠模型的复制见有采用苦寒泻下法[6]与过劳+睡眠剥夺法[2]的报道。2种方法诱导的模型小鼠均不同程度地表现出体质量降低、大便失调等脾虚症状，并伴有比目鱼肌收缩张力、湿重以及肌纤维横截面面积降低。从中医病因或发病学的角度来看，苦寒泻下法虽可致苦寒伤脾，但过量苦寒方药可以导致脾阳不足甚则引起毒性损伤；而过劳与睡眠剥夺法虽涉及过劳伤脾，也会伤及心神以致心脾两虚。同时，由于对2种模型复制过程中动物的系统变化未进行动态观察，其作为中医脾虚肌萎证的动物模型尚待评价。

本团队曾采用“饮食失节+过度疲劳”法成功复制出脾虚肌无力大鼠模型，并对该模型进行了较为系统的研究[4,7]。考虑到大鼠和小鼠的生物类近性和不同研究对模型动物种类的差异需求。本次拟探索该法建立脾虚肌萎证小鼠模型的可行性，以丰富中医脾虚肌萎证动物模型的类型，为探讨中医脾主肌肉的病理生理学内涵、评价相关方药的治疗效应及其作用机制，提供更多可供选择的模型工具。本研究通过北京中医药大学实验动物伦理委员会审查，批号BUCM-4-2021030401-1018。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF级昆明小鼠60只，体质量(22±2)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2020-0033。所有动物提前1周购入，于动物房常规饲养，饲养条件光照节律12 L∶12 D(6∶00-18∶00)，室温20 ℃～25 ℃，以相对湿度(50±5)%。

1.2 试剂、仪器及设备

小鼠胃动素(motilin，MTL)、胃泌素(gastrin，GAS、)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6酶联免疫试剂盒、D-木糖测定试剂盒(北京瑞格博生物技术有限公司，货号分别为20210804.60243 M，20210804.60206 M，20210804.60416 M，20210804.60080 M，20210804.60013 M，20210804.60023 M，20210805.40029)；D-木糖(北京sigma公司，货号x3877-25 g)；无水乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，货号64-17-5、1330-20-7)；HE染色试剂盒、中性树胶封片剂(北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司，货号G1121、G8590)。

塑料钢化桶(桶口径50 cm、桶高60 cm，执行标准Q/WHC02-2002)，温岭大溪宏程塑料制品厂；YLS-13A型握力仪(货号008070020)，济南益延科技发展有限公司；TB-718c型生物组织包埋机，湖北泰维科技实业有限公司；Leica RM2235组织切片机、Leica HI1220烤片机、Leica ST5020全自动组织脱水机，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司。

2 方法

2.1 分组、造模与取材

适应性喂养7 d后，全部动物于实验前进行负重预游泳(分别负重体质量的5%、6%、7%)，选择合适的负重条件，将所有小鼠随机分为正常组与模型组各30只。模型组小鼠采用“饮食失节+过度疲劳”法[7]建立脾虚肌萎证小鼠模型：隔日喂食(隔日禁食，隔日足量给食)；每日上午8∶30将小鼠尾部1/3～2/3处贴绑一定重量的铅皮，缓慢将其置于盛有温水(水温25 ℃，水深22 cm)的塑料钢化桶中进行负重游泳至力竭，记录其入水至力竭的时间。力竭判断标准[8]为：小鼠头部沉入水底超过3 s不能回到水面和/或头部连续沉入水面3次；迅速捞起小鼠，吹干毛发，连续28 d。分别于造模的第14天、第28天禁食不禁水16 h，第15天、第29天给各组小鼠灌服3%D-木糖溶液(1 mL/kg)，1 h后眼球取血、脱脊椎处死小鼠，于冰上迅速取出胸腺、脾脏与腓肠肌。

2.2 一般情况观察

2.2.1 一般外观行为学 于实验进行的每周三和周日观测并记录各组小鼠的一般外观行为(活动状态、皮肤毛发与大便状态)变化，并给予评分。参考文献[9]制定外观行为的各项评分标准(见表1)。统计每周各组小鼠外观行为各项变化的积分，取每周2次观测的均值，并分别统计各指标群的积分。

表1 大鼠外观行为分项及其评分标准

2.2.2 体质量与饮食量观察 实验期间每周六、日(8∶10～8∶30)各称取小鼠体质量1次，取2次的平均值。另每周2次于喂食日上午9∶00按20 g/只向小鼠投放基础饲料，24 h后称取剩余饲料质量，日饮食量(g)=20(g)-剩余饲料质量(g)，日均饮食量取2次测量的均值。

2.3 行为学检测

2.3.1 负重游泳力竭实验 于第1、2、3、4周末进行，参考文献在小鼠尾部1/3～2/3处固定其体质量6 %的铅皮，将小鼠面朝桶壁，轻轻置于直径50 cm、水温25 ℃、水深22 cm 的塑料桶中，以小鼠头部沉入水底超过3 s不能回到水面和/或头部连续沉入水面3次为结束点，记录各只小鼠力竭时间，即入水至结束点的经时[10]。

2.3.2 抓握力检测 各组小鼠分别于实验第1、2、3、4周末(17∶00)使用抓握力测定仪测定其抓握力。具体方法：抓握力仪进行校准后，左手抓住小鼠后颈、右手抓住小鼠尾部，使其双前肢抓紧传感器而后肢悬空，沿传感器纵轴轻拉小鼠尾部直至其四肢全部离开传感器，记录屏幕上显示的抓握力值，每只小鼠重复测量2次取其均值。

2.4 实验室指标检测

2.4.1 脏器指数 处死各组小鼠后，分别称取小鼠胸腺与脾脏质量，按照下列公式计算胸腺与脾脏指数：脏器指数(mg/g)=器官重量(mg)/体质量(g)[11]。

2.4.2 血清指标检测 采用Elisa法测定各组小鼠血清D-木糖、GAS、MTL、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

2.4.3 腓肠肌湿重与湿重/体质量比检测 取材后直接称量各组小鼠的腓肠肌湿重；湿重/体质量比按照以下公式进行计算：湿重/体质量比(mg/g)=腓肠肌湿重(mg)/体质量(g)。

2.5 腓肠肌病理检测

腓肠肌组织经过脱水、透明、石蜡包埋，形成长方形石蜡块切片，厚度约为5 μm，后经过HE染色与中性树封胶片，采用K-Viewer图像采集系统软件对腓肠肌的病理形态进行观察与描述[12]。随机选取HE切片5个不同视野，分别取其40根肌纤维和10个肌纤维，利用Image J软件计算肌纤维直径平均值和横截面面积[13]。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况观察结果

3.1.1 一般外观行为状态的变化 实验期间，正常组小鼠的外观行为未见明显异常。造模2周后，模型组小鼠逐渐出现活动减少甚至扎堆、毛发少泽甚则枯乱、大便稀溏等变化。图1示，与正常组比较，模型组小鼠第2周至第4周活动状态、皮肤毛发及大便状态积分均明显升高(P<0.01)。

注：与正常组比较：**P<0.01

3.1.2 体质量的变化 图2示，与正常组比较，模型组小鼠第1周至第4周体质量均明显降低(P<0.01)。

注：与正常组比较：**P<0.01

3.1.3 日均饮食量的变化 图3示，与正常组比较，模型组小鼠日均饮食量第1周明显增加(P<0.01)，第3周至第4周均明显降低(P<0.01)。

注：与正常组比较：**P<0.01

3.2 行为学检测结果

3.2.1 负重游泳力竭时间的变化 图4示，与正常组比较，模型组小鼠第2周至第4周各点游泳力竭时间均明显缩短(P<0.05，P<0.01)。

注：与正常组比较：**P<0.01，*P<0.05

3.2.2 抓握力的变化 图5示，与正常组比较，模型组小鼠实验期间各时间点的抓握力均明显降低(P<0.01)。

注：与正常组比较：**P<0.01

3.3 实验室指标检测结果

3.3.1 脏器指数的变化 图6示，与正常组比较，模型组小鼠第2周和第4周的胸腺指数、脾脏指数均明显降低(P<0.05，P<0.01)。

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.3.2 血清指标的变化 图7示，与正常组比较，模型组小鼠第2周和第4周的血清D-木糖、GAS、MTL、IL-1β以及TNF-α含量均明显降低(P<0.05，P<0.01)，第2周和第4周的血清VIP与IL-6含量明显增高(P<0.05)。

注：与正常组比较：**P<0.01，*P<0.05

3.3.3 腓肠肌湿重与湿重/体质量比的变化 图8示，与正常组比较，模型组小鼠第2周和第4周腓肠肌湿重、湿重/体质量比均明显降低(P<0.05)。

注：与正常组比较：*P<0.05

3.4 腓肠肌病理形态的变化

图9示，正常组小鼠腓肠肌肌纤维排列紧密整齐，形态饱满，呈不规则多边形且结构清晰；模型组小鼠腓肠肌纤维排列松散，边缘变钝，肌纤维间隙与肌束间隙明显变宽。图10示，与正常组比较，模型组小鼠第4周腓肠肌纤维直径明显缩短、肌纤维横截面面积明显减少(P<0.05，P<0.01)。

图9 各组小鼠第4周腓肠肌病理形态的改变(HE 10×10)

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

脾主肌肉是中医脾脏重要的生理属性之一，由于脾虚涉及范围较广，临床脾虚不一定必然伴有肌肉无力表现，因此脾虚引起的肌萎是脾虚的一种特殊病证类型。建立脾虚肌萎证的动物模型对于研究脾主肌肉的现代内涵及评价临床有效方药具有重要意义。

目前学界并未有脾虚肌萎证模型标准的设定。基于脾虚肌萎证的中医内涵，该证的判断标准通常应包括中医脾虚与肌肉损伤2个方面。其中脾虚的评价涉及外观表征和实验室指标的异常。在符合中医脾虚证标准的基础上，出现肌肉损伤应该是评价脾虚肌萎证模型复制成功的必要证据[2,6]。

当前脾虚肌萎证的模型复制方法主要有4种，其中苦寒泻下法[1]模拟中医苦寒伤脾导致脾气受损，即采用苦寒泻下类药物给予动物灌胃，结果显示模型大鼠逐渐出现消瘦、便溏等症状，肌肉中肌糖原含量明显降低，提示模型具有脾虚肌肉损伤。但此法涉及苦寒药味的过用，多会涉及脾阳受损的病机。劳倦过度+睡眠剥夺法[2]主要是基于中医劳倦伤脾的发病学认识，采用剥夺动物部分睡眠时间联合力竭游泳方法，结果显示模型小鼠出现体质量减轻、毛色枯槁等脾虚表现，同时小鼠的比目鱼肌湿重与肌纤维面积均明显降低。不过该法中的剥夺睡眠会损伤心神，以致模型具有心脾两伤的病机特点。苦寒泻下+劳倦过度+饮食失节法[5]采取中医脾虚的多个病因复合使用，即给予大鼠大承气汤灌胃，联合负重游泳力竭及饥饱失常，结果观察到模型大鼠逐渐出现进食减少、体质量降低以及大便不调等表现，同时伴有抓握力降低，骨骼肌线粒体呈空泡样变，符合脾虚肌萎证模型的判断。但本法操作较为繁琐，且短时间内多因素合用存在急性损伤的机制，对复制过程中模型动物的动态变化未行观察，相关模型的明确成模时间尚不清楚。且上述3种方法在模型复制中仅对动物外观表征与肌肉损伤方面进行了观察，未涉及对脾虚证相关实验室指标的评价，故在模型的判定上尚存在不足。

劳倦过度+饮食失节法是目前建立脾虚肌萎证模型应用较多的方法。本团队[4,7]曾采用该法连续4周对复制中的大鼠脾虚证和肌肉的变化进行了动态观察，结果发现复制2周时的模型大鼠即表现出脾虚相关症状和实验室指标异常及抓握力降低，之后随着造模时间的延长症情逐渐加重，并出现骨骼肌的萎缩性病变。多次重复实验表明，该模型具有中医脾虚肌萎证的证候特点。该法在方法学上稳定且易于操作，适于推广，但目前尚未被用于小鼠模型的复制。

本次实验观察到，该法诱导的模型小鼠在实验2周即可见出现被毛无泽、活动减少、大便溏泄等症状，且随着造模时间的延长症状加重，体质量下降，饮食量明显减少，游泳力竭时间缩短，与大鼠模型观察到的结果[4]一致。实验室指标的变化通常也是判断脾虚动物模型的重要参数。已知D-木糖口服可反映小肠吸收功能，外周血或尿中D-木糖含量的降低是脾虚证临床病理表现之一[14]。GAS与MTL均属于消化道激素，主要生理功能为促进胃肠道的分泌和增加胃肠道对水、电解质的运输[15]。VIP则是具有刺激小肠液分泌、促进肠道水分和电解质分泌作用的一种神经递质[16]，这些指标均与脾主运化的功能相关。有研究观察到，采用腹腔注射利血平14 d建立的脾虚模型小鼠血清D-木糖和GAS含量明显降低[17]，大黄水煎剂灌胃7 d诱导的脾虚模型小鼠血清MTL水平明显降低[18]，VIP含量明显升高[19]，提示脾虚模型小鼠胃肠功能减退与其胃肠激素失调有关。本实验也观察到，模型组小鼠第2周、第4周血清GAS、MTL和D-木糖含量均明显降低，VIP含量明显升高，表明该模型小鼠确实存在胃肠和小肠功能的减退，从而导致食量减少、大便稀溏及体质量减轻等症。

脾化生气血而能充养脏腑和防御外邪。脾虚证常伴有免疫系统的异常，因此胸腺与脾脏指数的变化及相关免疫因子的改变常被作为脾虚证的佐证之一[20，21]。外周循环中IL-1β、TNF-α与IL-6通过诱导免疫细胞的增殖与分化，提高中性粒细胞的吞噬能力等参与免疫调节[22，23]。一些研究观察到，大黄水煎液[24]与番泻叶水煎液[25]灌胃8 d建立的脾虚小鼠模型胸腺指数与脾脏指数均明显降低，利血平腹腔注射[26]14 d诱导的脾虚小鼠模型血清TNF-α含量明显降低，但IL-6含量明显升高。本次研究观察到，脾虚模型小鼠第2周与第4周的胸腺和脾脏指数、血清IL-1β以及TNF-α含量均明显降低，表明该法也可引起小鼠的脾虚证候。本次实验还观察到，模型小鼠的血清IL-6含量明显升高，提示脾虚模型小鼠存在免疫功能调节方面的异常，但血清IL-6含量升高的原因尚待探查。

脾虚证可出现倦怠乏力、四肢无力等表现，但目前尚未有关于“四肢无力”症状的定量描述[27]。本团队前期曾引入强迫游泳实验和抓握力测试以评价模型大鼠的整体耐力(气虚)和骨骼肌的肌力强度(肌萎证)[4]。本次实验观察到，模型小鼠从实验第2周时即出现抓握力降低，至4周时降低更为明显，与游泳力竭时间的变化趋势一致，表明随造模时间的延长，小鼠的体力及肌力下降日趋加重。本次实验还观察到，模型小鼠第2周和第4周的腓肠肌湿重以及湿重/体质量比均明显降低，第4周的镜下腓肠肌纤维排列松散，边缘变钝，肌纤维间隙与肌束间隙明显变宽，肌纤维的直径与横截面面积均明显减少，表明模型小鼠骨骼肌不仅出现肌力减退，而且还伴有一定程度的萎缩性病变。

综上，小鼠采用“饮食失节+疲劳过度”法诱导4周可以成功复制出中医脾虚肌萎证模型。