针刀调节Ca2+抑制膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡的实验研究❋

陈 倩，黄小双，杨永晖，耿 凯，刘存斌，李 韬，吴亮亮，林秀华，施婧婧

(1.安徽中医药大学，合肥 230038；2.安徽中医药大学第三附属医院，合肥 230061)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种中老年人常见的慢性退行性疾病，我国KOA的发病率为5.4%～30.5%[1，2]。目前西药治疗KOA存在长期疗效较差、胃肠道损害以及肾损伤等弊端[3，4]，针刀治疗KOA临床疗效良好，可以明显改善KOA疼痛和功能障碍等症状，具有安全性高、起效快、创伤小等优点[5，6]。

针刀治疗KOA的作用机制研究，目前大多围绕肌肉力学、细胞免疫反应、炎症因子、基质金属蛋白酶等方面开展[7-13]。膝关节软骨细胞的凋亡是KOA的主要发病因素之一，而细胞凋亡与Ca2+的浓度密切相关[14，15]。大量的Ca2+可以促进凋亡加速[16]，加快膝关节软骨退变与损伤。在Ca2+释放过程中，钙调蛋白(Calmodulin)、钙蛋白酶(Calpain)数量会变多，而钙网蛋白(Calreticulin)数量会减少。鉴于针刀调控膝软骨细胞内Ca2+的浓度以抑制凋亡的机制研究尚不多见，本研究建立KOA大鼠模型，观察大鼠膝软骨细胞Ca2+含量、Calmodulin、Calpain、Calreticulin及Caspase家族的表达水平，旨在探讨针刀疗法是否能够通过调节膝软骨细胞内Ca2+的浓度，进而抑制膝软骨细胞凋亡，为针刀治疗KOA提供新的实验依据。本研究通过安徽中医药大学动物伦理委员会批准，批准号AHUCM-rats-2020011。

1 材料与方法

1.1 动物

选用SD清洁型雄性大鼠72只，体质量(250±20)g，购自江苏省邳州市东方养殖有限公司，实验动物许可证号SCXK(苏)2014-0005。饲养于室温(22±2)℃、湿度(55±15)%、光照与黑暗12 h、普通标准饲料、自由活动、自由饮食与摄水的环境中。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol(Life technogie公司，货号15596026)；荧光染料试剂盒(novoprotein公司，货号E096-01B)；预染蛋白Marker与ECL超敏发光试剂盒(Thermo公司，货号26616、34095)；β-Actin、山羊抗小鼠IgG与山羊抗兔IgG(Zsbio公司，货号TA-09、ZB-2305、ZB-2301)；Caspase-3、Caspase-9(abcam公司，货号ab184787、ab202068)；Caspase-12(Bioss公司，货号bs-1105R)；DMEM培养基(Sigma公司，货号D5796)；钙离子检测试剂盒(碧云天公司，货号S1052)；胎牛血清(Gibco公司，货号04-001-1ACS)；DAPI染色液、抗荧光淬灭封片液(Beyotime公司，货号C1005、P012)；FITC(abcam公司，货号ab6785)；荧光一抗Calmodulin、Calreticulin(abcam公司，货号ab61001、ab92516)，Calpain(Bioss公司，货号bs-1099R)；针刀(江西老宗医，0.35 mm×30 mm)。

Olympus CX4光学显微镜、JEM1400 透射电镜(日本电子公司)；A001-1-1102流式仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；PIKOREAL 96荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技有限公司)；OD-1000超微量分光光度计(南京五义科技有限公司)。

1.3 动物选模分组与制备

适应性饲养1周后，将动物按随机数字表法分为正常组、模型组、针刀组和药物组各18只，除正常组外，其余3组均进行KOA鼠造模。造模采用膝关节腔药物注射法[17]，预先调配2%(w/v)木瓜蛋白酶和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合液，充分混匀后静置30 min，4 ℃冷藏备用。每周第1、3、5天注射3%戊巴比妥钠(0.3 mg/kg)进行腹腔麻醉，按0.1 mL/kg 剂量在大鼠左膝关节腔内注射建立模型，建模时间共4周，造模成功后休息1周，待动物状态稳定后进行干预治疗。在实验过程中，对SD大鼠的精神、饮食及活动状态进行观察。4周后大鼠造模侧出现屈伸功能障碍、跳步、拖步、活动减少，lequesne MG评分≥6分则为造模成功。

1.4 干预方法

正常组常规饲养，不做任何干预；模型组造模成功后常规饲养，不做任何干预；药物组造模成功1周后患膝局部外抹双氯芬酸二已胺乳胶剂，每日2次，连续4周；针刀组造模成功1周后行针刀干预，每周治疗1次，连续4周。

针刀操作方法：在左膝关节周围股四头肌腱和内、外侧副韧带附近寻找条索或结节状物作为针刀的进针点，以手术用无菌记号笔标记，常规备皮、消毒后依次行针刀治疗，即将刀口线平行于下肢纵轴垂直于皮肤快速刺入，到达骨面后稍微上提针刀并旋转90°，使针刀与下肢纵轴垂直，快速切割条索或结节状物3～5刀，出刀后以无菌纱布压迫止血。

1.5 检测指标

1.5.1 国际骨关节炎量表评分(lequesne MG) 各组大鼠分别在造模前、造模后、干预后进行改良lequesne MG评分：局部疼痛刺激反应(0～3分)，步态改变(0～3分)，关节活动度(0～3分)，关节肿胀(0～2分)，总分范围为0～11分。

1.5.2 膝关节软骨细胞HE染色 每组随机选取2只大鼠用0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，在鼠板上固定，用23号手术刀片打开膝关节，切除髌骨暴露大鼠左膝关节胫骨平台和股骨下髁的软骨，快速切取股骨内、外侧髁处2 mm×2 mm大小的新鲜软骨组织，将标本投入10%甲醛溶液中固定，HE染色，光学显微镜下观察关节软骨细胞数量改变。

1.5.3 膝关节软骨电镜检测 每组随机选取2只大鼠，同上方法快速切取股骨内、外侧髁处1 mm×1 mm×1 mm的新鲜软骨组织，并固定在电镜固定液中。按照常规透射电镜样本制备流程进行漂洗、锇酸固定、脱水、包埋、超薄切片，经柠檬酸铅、醋酸铀双重染色，在JEM1400型透射电镜下观察软骨细胞结构形态并摄片。

1.5.4 流式细胞术检测Ca2+浓度 大鼠膝软骨细胞提取与培养：每组随机选取4只大鼠，无菌操作下选取大鼠膝关节软骨。提前准备好胰酶、含0.02%胶原酶II和15%FBS的DMEM高糖培养液作为消化液(37 ℃预热)。将软骨依次放到装有PBS和无血清DMEM高糖培养液的培养皿中涮洗，洗去可能残留的血污和脂肪。把软骨切割成小块，放入1.5 mL离心管中加入少量的PBS剪碎，将剪碎的软骨倒入0.25%的胰酶中消化1～2 h，离心、弃掉胰酶消化液，向含有软骨块的沉淀中直接加入胶原酶消化液过夜，沉淀加入含15%FBS的DMEM高糖培养液清洗一次，重悬之后直接接种到培养皿中等待细胞爬出。细胞汇合度达到约90%以上时用胰酶将细胞消化、传代。

流式前处理：用PBS洗涤细胞2次，按照1∶1000稀释Ca2+母液，将稀释好的Ca2+溶液重悬细胞沉淀，避光孵育后离心收集沉淀Ca2+细胞。处理完毕后进行流式检测，用Ca2+-FITC(激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm)的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测。

1.5.5 实时荧光定量PCR 每组选取3只大鼠，同上方法选取大鼠左膝关节股骨内、外髁以及胫骨平台处的软骨，置于-80 ℃保存待测。采用实时荧光定量PCR检测大鼠膝关节软骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12基因表达水平，取50～100 mg组织剪碎后液氮磨匀，Trizol法提取组织中总RNA，分光光度计计算RNA的纯度及浓度；逆转录试剂盒进行反转录使RNA转换成cDNA，其中总RNA质量约为1 μg进行PCR反应，反应体系为10 μL，cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green mixture 5 μL、RNase Free water 2 μL；反应结束后，以2-ΔΔCT表示目的基因相对表达量。引物由Sangon Biotech公司合成(见表1)。

表1 目的基因引物序列

1.5.6 Western blot检测 每组选取3只大鼠，同上方法选取大鼠左膝关节软骨，选取组织约100 mg，加入RIPA细胞裂解液进行裂解，收集蛋白样品变性、电泳、转膜、封闭。选择合适的一抗稀释液(Caspase-3 1∶2000，Caspase-9 1∶2000，Caspase-12 1∶1000)、二抗稀释液(1∶20000)孵育，ECL发光试剂盒检测蛋白，以β-actin为内参进行校准，采用各自的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值作为该蛋白的相对表达量，运用Image J软件进行胶片条带的分析。

1.5.7 免疫荧光组化 每组随机选取4只大鼠，同上方法选取大鼠的膝关节软骨制作切片(厚度为3 μm)，干燥烘烤，二甲苯透明，梯度脱水，抗原高压修复，山羊血清封闭，一抗(Calmodulin1∶200、Calpain1∶200、Calreticulin1∶300)孵育1 h，再加入二抗(1∶400)孵育、冲洗、甩干，用抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)封片，最后数字切片扫描仪扫描荧光切片。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠lequesne MG比较

图1示，治疗前3组大鼠lequesne MG评分差异均未见统计学意义(P>0.05)；与干预前比较，针刀组和药物组干预后lequesne MG评分明显降低(P<0.05)；与模型组比较，针刀组和药物组干预后lequesne MG评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：1)与模型组治疗后比较：P<0.05；与本组治疗前比较：2)P<0.05

2.2 HE染色结果

图2示，正常组大鼠膝关节软骨面结构完整，软骨细胞数量较多且排列整齐。模型组与正常组比较，大鼠膝关节软骨面粗糙不平滑，软骨细胞数量明显减少且排列混乱。针刀组和药物组与模型组比较，大鼠膝关节软骨面较为完整且平滑，软骨细胞数量显著增多，排列顺序也较整齐规律。

注：A.正常组；B.模型组；C.药物组；D.针刀组；图2-B为图2-A中蓝框部分的放大图

2.3 关节软骨电镜结果

图3示，正常组细胞核内染色质分布匀称，细胞核膜完整，内质网、线粒体结构正常；模型组细胞染色质分布不均匀，细胞核膜皱缩严重，出现核膜染色质边集形态，粗面内质网扩张，有空泡的形成；针刀组和药物组与模型组比较，细胞膜染色质较均匀，核膜形态较正常，无边集形态，可见少量的空泡和粗面内质网扩张形态。

注：A正常组；B模型组；C药物组；D针刀组；红色箭头指向细胞核

2.4 Ca2+检测结果

图4示，横坐标为前向角代表细胞大小。纵坐标为侧向角，代表细胞内部复杂程度。图框中红色部分为细胞离散后可作为Ca2+流式检测的部分细胞。图5示，横坐标代表Ca2+平均荧光强度，纵坐标代表细胞数量。与正常组比较，模型组流式图整体向横坐标右侧平移；与模型组比较，药物组和针刀组流式图整体向横坐标左侧平移；与药物组比较，针刀组流式图整体向横坐标左侧平移。

图4 各组大鼠膝关节软骨Ca2+流式散点图(n=4)

图5 各组大鼠膝关节软骨Ca2+荧光强度流式图(n=4)

图6示，Ca2+的荧光强度可反映Ca2+浓度，Ca2+的荧光强度越强则Ca2+浓度越高。与正常组比较，模型组的Ca2+平均荧光密度显著增高(P<0.05)；与模型组比较，针刀组和药物组的Ca2+平均光密度明显低于模型组(P<0.05)；与药物组比较，针刀组的Ca2+平均光密度低于药物组(P<0.05)。

注：与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与药物组比较：3)P<0.05

2.5 各组大鼠膝关节软骨免疫荧光检测结果

DAPI是一种荧光染色剂，细胞核呈蓝色荧光。Calmodulin、Calpain、Calreticulin在细胞核内表达，呈绿色荧光，Merge为蓝色、绿色荧光表达的组合比较(见图 7～9)。

图7 各组大鼠膝关节软骨Calmodulin表达比较(n=4)

图8 各组大鼠膝关节软骨Calpain表达比较(n=4)

图9 各组大鼠膝关节软骨Calreticulin表达比较(n=4)

图7、8示，正常组绿色荧光分布较少，模型组绿色荧光数量明显增多；与模型组比较，针刀组和药物组绿色荧光显著减少。图9示，正常组可见较多的绿色荧光，模型组绿色荧光分布明显减少；针刀组、药物组与模型组比较，绿色荧光数量增多。

图10示，与正常组比较，模型组Calmodulin、Calpain蛋白表达明显升高(P<0.05)，Calreticulin蛋白表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，针刀组和药物组Calmodulin、Calpain蛋白表达明显降低(P<0.05)，Calreticulin蛋白表达明显升高。其中，针刀组的Calmodulin、Calpain蛋白表达低于药物组(P<0.05)，Calreticulin蛋白表达高于药物组(P<0.05)。

注：与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与药物组比较：3)P<0.05

2.6 实时荧光定量PCR实验结果

图11示，模型组大鼠膝关节软骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表达水平均明显高于正常组(P<0.05)；针刀组、药物组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表达水平均明显低于模型组(P<0.05)，其中针刀组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的mRNA表达水平明显低于药物组(P<0.05)。

注：与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与药物组比较：3)P<0.05

2.7 Western blot检测结果

图12示，模型组大鼠膝关节软骨Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，针刀组和药物组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与药物组比较，针刀组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与药物组比较：3)P<0.05

3 讨论

膝骨关节炎为常见的慢性疾病，属于中医学“痹证”范畴[18]。针刀疗法是中医学治疗KOA的一大特色，通过松解肌肉的疤痕、挛缩组织，调节肌肉力学平衡，缓解疼痛并改善膝关节的活动度，可以达到治疗KOA的目的。膝软骨细胞的凋亡是KOA的重要发病机制之一[19]，抑制膝关节软骨细胞凋亡可以改善软骨的退变程度治疗KOA。

膝软骨细胞的凋亡会促进软骨细胞大量减少，从而加重膝软骨的破坏，加快KOA的发生发展。本研究发现，KOA大鼠软骨面粗糙破损，软骨细胞大量减少，排列紊乱无规律，膝软骨细胞核染色分布不均匀，且细胞核膜固缩现象严重，针刀、药物干预后可见大鼠软骨面平整清晰，软骨细胞增多且排列整齐，软骨细胞核膜形态较为正常，提示针刀疗法可以抑制膝软骨细胞的凋亡，具有促进膝软骨修复、抑制膝关节退行性改变的作用。

研究表明，Ca2+是第二信使，是参与细胞凋亡的重要物质，且Ca2+的浓度越高持续的时间越长，越容易促进细胞凋亡的发生[20-22]。Calmodulin是Ca2+的传感器，在Ca2+释放过程中被激活，促使凋亡发生[23，24]；Calpain是细胞内钙浓度依赖型中性半胱氨酸内肽酶，可以随Ca2+的浓度升高而升高，裂解细胞结构，加快凋亡进程[25，26]；Calreticulin是一种内质网驻留蛋白，与Ca2+的稳定性密切相关[27，28]，通过结合Ca2+使其浓度降低[29]，减缓凋亡发生。

本实验发现，KOA大鼠膝关节软骨Ca2+浓度明显高于正常大鼠，Calmodulin、Calpain表达数量较多，Calreticulin数量较少，提示膝软骨细胞凋亡发生，KOA进展加快。经过针刀干预治疗后，Ca2+浓度显著减少，Calmodulin、Calpain表达减少，Calreticulin明显增多，表明针刀治疗调控膝软骨细胞中的Ca2+浓度，使Calmodulin、Calpain 和Calreticulin表达趋于正常水平，进而抑制膝软骨细胞凋亡。

Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12是促进凋亡发生的重要因子。目前研究表明，Caspase-9为凋亡始动子，位于级联反应上游；Caspase-3为凋亡效应子，位于级联反应下游，被上游始动子激活后会作用于特异性底物，使得细胞发生生化及形态学的改变，从而导致细胞凋亡；Caspase-12位大鼠体内特有，在外源性细胞凋亡传导通路中起辅助作用[30，31]。本研究发现，KOA大鼠膝关节软骨组织中Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12表达量较高，针刀干预后显著减少，结合相关分析认为针刀可以抑制Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的激活，从而减缓凋亡的发生，对大鼠膝关节软骨具有保护作用。

双氯芬酸二乙胺乳胶剂是一种前列腺素合成的抑制剂，具有消炎、镇痛的作用[32]。使用双氯芬酸二乙胺乳胶剂干预后，KOA大鼠膝软骨Ca2+的浓度降低，Calmodulin、Calpain表达减少，Calreticulin表达增多，表明膝关节软骨细胞的凋亡减少，但针刀疗法抑制凋亡的作用优于双氯芬酸二乙胺乳胶剂。针刀疗法以经筋理论为总纲，以网眼理论为基础[33]，结合九针技术与人体解剖学，是传统针灸学的继承与发展。《素问·痿论篇》中提到经筋的生理功能“主束骨而利机关”，经筋病主要表现为经筋分布之处的筋肉挛急、掣引、痹痛、转筋、强直、弛缓等。如《灵枢·经筋》所言：“经筋之病，寒则反折筋急，热则筋弛纵不收，阴痿不用。阳急则反折，阴急则俯不伸”。KOA正属于经筋病的范畴，膝部气血不通，不通则痛，表现为膝关节局部软组织疼痛、活动受限。针刀疗法通过松解周围软组织挛缩，从而调节膝关节周边肌肉力学的平衡，疏通膝部气血，达到疏通经络、活血化瘀之功[5,34，35]。

以上研究发现，针刀可以通过调节Ca2+释放，使Calmodulin、Calpain表达减少，Calreticulin表达增多，并抑制Caspase家族的激活，减缓膝软骨细胞凋亡的发生，改善膝关节软骨退变的情况，达到治疗KOA的目的。然而，细胞的凋亡途径复杂，且多因素相互影响相互作用。本研究对于针刀调节Ca2+释放的机制进行了初步观察但仍比较浅显，还需要今后进行更深层次的探讨。