非洲猪瘟病毒基因缺失株的快速检测方法研究进展

江波杨蓉

（乐山市夹江县动物疫病预防控制中心，四川乐山 614100）

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪群引起的一种急性、重症、出血性传染病[1]。ASF的临床解剖变化与急性经典猪瘟(Classical swine fever,CSF)相似，临床诊断时常被误诊为CSF。由于国际贸易的流动性，ASFV很容易在猪群之间传播。该病原于1921年在东非的肯尼亚首次被报道，随后在欧洲地区、拉美地区被相继发现。2007年，该病毒首次进入格鲁吉亚共和国，随后蔓延至俄罗斯等地区[1]。我国于2018年8月在沈阳市首次发现了ASF病例，疫情发展迅速并对我国的养猪业造成了严重的损失。ASF的潜伏期通常为4～19 d，发病率为40%～85%，发病的严重程度取决于毒株是否引起猪的急性或亚急性发病、毒株毒力、感染途径及是否存在出血。由于ASFV可以通过多种传播方式进行传播，且没有疫苗和特效药物治疗[2]，因此，生物安全防控是现阶段的主要防控方法。

ASFV是一种线性双链DNA病毒，具有二十面体的多层结构，整个病毒基因组长约170～193 kb。同时，该病毒编码约50多种结构蛋白[3]。其中，MGF家族基因组由中间的125 kb保守区和左侧约35 kb和右端约15 kb的可变区组成。这两个区域包含5个多基因家族(MGF)组，这些基因组与调节免疫反应和宿主特异性有关，根据其平均氨基酸长度命名的包括MGF360、MGF110、MGF505/530、MGF300和MGF100，可能是由基因复制和多样化衍生而来的，并且在不同的ASFV毒株中具有不同的互补性，也是ASFV中最丰富的基因区[4]。其中，MGF360基因是ASFV的主要毒力基因的一部分，其本身含有约20个成员，缺失MGF360后ASFV致病性会大幅度降低，因此，该基因家族是ASFV基因缺失疫苗优先被敲除的基因之一[5,6]。

目前，针对该病没有安全有效的疫苗和药物进行控制，使得ASF疫情在全球快速传播并难以控制，有效的防控措施还是早期的病毒检测和严格的消毒。此外，我国分离的ASFVSY18株，缺失MGF后可显著降低病毒毒力。同时，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所针对ASFV构建CD2V与MGF双基因缺失株作为ASF疫苗候选株。因此，ASFV的早期诊断和检测就显得尤为重要，本文将根据ASFV的MGF360家族基因检测方法的研究进展进行综述。

1 非洲猪瘟的病原学检测技术

1.1 非洲猪瘟病原鉴定

血细胞吸附试验(Haemadsorption test,HAD)的检测原理是猪红细胞会吸附在感染ASFV的单核细胞或巨噬细胞表面，该试验阳性结果可作为ASF诊断的最终标准，但由于该技术对试验技术要求过高，且诊断周期较长，需要专门的设备及相关的培训。因此，该技术常作为ASFV检测的参考。

1.2 普通PCR检测方法

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)是检测ASF的常用方法，可以在合适的温度循环下使用PCR扩增子完成目的片段的扩增。该方法具有简单快速、灵敏度高、特异性强等特点，且生物安全性高，能够实现非洲猪瘟的早期诊断，是目前实验室对病原检测的常用方法之一。Aguero等[7]基于对7种不同ASFV代表性毒株的VP73基因(VP72基因的一部分)核苷酸序列的比较，建立了一种新的ASFVPCR检测方法，该检测方法被世界动物卫生组织陆生动物诊断试验和疫苗手册推荐。

多重PCR的原理与常规PCR几乎相同，该技术不仅保持了普通PCR的特点，且一次可以扩增多个病原的目的片段，能够用于多种病原感染的快速诊断，对检测多种病毒感染具有重要的指导意义。Liu等[8]基于非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和基因组高度保守的区域设计了3对特异性引物，在不同反应条件下建立了ASFV、CSFV(经典猪瘟病毒)和APPV(典型猪瘟病毒)的多重逆转录聚合酶链式反应(mRT-PCR)检测方法。mRT-PCR测定包括2个步骤，即逆转录(RT)和mPCR，该检测对ASFV、CSFV和APPV具有高度特异性、敏感性和可重复性，不与其他病原发生交叉反应，最低检测限度为6.34×102copies/μL(ASFV) 和 6.34×101copies/μL(CSFV和APPV)。

1.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time,qPCR)是病原体检测的首选，也是ASFV检测的金标准。qPCR是一种利用非特异性SYBR Green Ⅰ荧光染料和特异性水解荧光探针TaqMan完成目的核酸定量的检测技术，已有学者建立了针对ASFVp72基因的qPCR检测方法，涉及的引物—探针序列在该方法中已被世界动物卫生组织用作推荐序列。但这些方法对配套的反应仪器有严格的要求，需要专门的试验设备和相关试验技术，从而阻碍了该技术在基层和偏远地区的应用。王涛等[9]建立了一种以MGF360-13L基因为靶标的qPCR检测方法，检测限最低为1.56×104copies/μL。韩勇军[10]等根据ASFV的MGF360-14L基因、CD2v基因建立鉴别非洲猪瘟病毒野生株和基因缺失株的多重荧光定量PCR，结果显示，最低检测限为100 copies/μL。林彦星[11]等根据ASFV的646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了鉴别ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR，其灵敏度比世界动物卫生组织推荐的荧光PCR高10倍，该方法的建立对后期非洲猪瘟病毒基因缺失苗的研发与推广及ASF防控具有重要的指导意义。Guo等[12]基于非洲猪瘟病毒的B646L基因和MGF505-2R基因建立了用于检测和区分广泛型和基因缺失型的ASFV TaqMan PCR检测方法，该方法特异性高，不与其他病原发生交叉反应。对B646L和MGF505-2R基因的标准质粒的检测限分别为 5.8 copies/μL和 3.0 copies/μL。

1.4 等温扩增法

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)由日本学者Notomi开发，使用2～3套引物和1种具有复制活性的聚合酶，可在15～60 min，65℃的恒温下完成目标片段的扩增。目前，该方法已用于检测ASFV。James[13]开发了用于检测ASFV的一步环介导扩增(LAMP)检测方法。将该检测方法与用于ASF诊断的其他实验室检测方法进行比较。环介导等温扩增法为检测ASFV提供了一种基于PCR检测的替代方法，可能更适合在非专业实验室或移动实验室中使用。沈永义等[14]公开发明了一种区分ASF野毒株和MGF360/505R基因缺失株LAMP检测引物及试剂盒，可用于现场检测。

1.5 重组酶聚合酶扩增技术 （RPA）

该技术是2006年由TwistDx Inc公司开发的一种新型等温扩增检测技术，即重组酶聚合酶扩增技术(Recombination polymerase amplification,RPA)。该技术主要依赖于结合单链核酸(即寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶等3种酶。RPA反应温度在37～42℃之间，整个反应在20～30 min内即可完成模板的扩增，得到新的双链DNA。该技术反应中的酶主要以冻干形式存在，有利于保存和运输。该技术还能与荧光定量技术和侧向流动免疫技术相结合，建立便于观察结果的检测方法。吴映彤[15]以MGF360-12/13设计合成PRA引物，优化并建立RPA快速核酸检测方法，最低检测限分别为1 000个拷贝数，且特异性及重复性较高。

1.6 微滴数字PCR检测技术

微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术，其原理是通过微流体芯片技术或微滴技术将样本分散成数万个单独反应室，每个DNA分子可作为单独的反应体系，分别进行PCR扩增，与传统的PCR相比，该技术克服了荧光定量PCR繁杂的标准曲线的建立，实现了对单分子DNA的绝对定量检测。邬旭龙[16]通过ASFV的K205R基因设计了1对特异性引物和TaqMan探针，建立实时荧光定量PCR(qPCR)和微滴数字PCR(ddPCR)检测方法，ddPCR的最低检测限度可达到0.36 copies/μL，检测灵敏度是qPCR的10倍。

2 血清学诊断技术

血清学诊断因其检测简单、成本相对较低、对专业设备要求不高，是最常用的非洲猪瘟病毒的检测方法。目前没有ASFV疫苗的上市，如果检测的猪群中非洲猪瘟病毒抗体呈阳性，则表明猪群中可能存在该病原。因此，抗体检测对于ASF的诊断尤为重要。目前，ASFV的血清学检测包括抗原检测和抗体检测，但抗原检测的条件更为严格。由于ASFV不能完全中和抗体，抗体检测逐渐成为主流的血清学诊断方法。世界动物卫生组织推荐的基于ASFV抗体的检测是用于抗体筛查的ELISA，并辅以其他确认性检测，如胶体金试纸条等。

2.1 ELISA检测方法

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种方便快捷的直接检测抗体的方法，具有操作方便、特异性较好、灵敏度高等特点，非常适合大批量样品的检测。如果要通过ELISA检测获得更准确的诊断结果，则必须进行更可靠的固相载体和纯化抗原。蒋智勇等[17]建立了基于CHO-K1细胞稳定表达ASFV的CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法，该方法检测ASFV阳性血清的敏感性可达1∶1 600，且批内与批间变异系数均小于10%。

ELISA具有检测快速、操作简单、成本相对较低等优点，是目前应用最广泛的ASFV检测方法。ELISA适用于急性病例，慢性病例检出率不高。因此，对于ELISA显示为阳性的样本，建议通过核酸、免疫印迹或间接荧光抗体检测等方法进行确认。

2.2 纸条检测方法

胶体金免疫层析技术(Immune colloidal gold technique,GICT)是一种简便快速、特异、敏感的检测技术，被广泛用于疫病快速检测。此外，此技术已广泛用于检测细菌、病毒、寄生虫、激素和抗体。还可以缩短检测时间、提高检测效率，且在临床检测时不需要专业设备和实验室人员，可在10 min内完成，生成的结果可以用肉眼直接读取。Wan等[18]已经开发了一种基于重组p30和截短的p72蛋白的胶体金双免疫层析技术。试纸条的灵敏度为1∶256，相当于市售的ELISA试剂盒。Geng等[19]开发了一种用于ASFV抗体检测的带有p72三聚体的胶体金免疫层析条，该试纸条比用于临床血清样本检测的商业ELISA试剂盒更敏感。

量子点(Quantum dot,QDs)属于纳米材料并具有半导体的属性，组成元素一般在Ⅱ～Ⅵ族，直径大约在1～100 nm左右。在生命科学研究领域中，常作为一种新型的材料(带荧光)。量子点免疫层析试纸条(Fluoro-immunechromatographic assay,FICA)是在量子点技术上开发出来的，与传统的试纸条相比，该技术可实现病原定量检测，也可提高QDs标记和偶联量。冯志新等[20]运用该技术发明了一种检测ASFV的CD2v与MGF360基因的黏膜抗体试纸条，在反应后采用365 nm紫外发射器就可完成检测结果判定，对口拭子的最大检测限为1∶64。

3 讨论

目前，ASFV基因型较多，主要包括pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5 和 p17，其免疫逃逸机制复杂多样，给疫苗研究带来诸多困难。由于没有市售的非洲猪瘟疫苗，分子诊断方法和血清学检测技术仍被认为是识别感染动物和控制ASF的主要手段。疫苗被认为是预防和控制非洲猪瘟的重要措施之一，已确认的MGF505/360基因缺失株或CD2v基因缺失株是最有可能成为非洲猪瘟疫苗的候选基因位点。此外，随着该毒株的流行与变异，市场也迫切需要能够区分ASFV基因缺失株的检测技术。