自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响

刘俪婷，徐 婷，姜 燕，苏朝江，张 帅，刘宗旸

1 贵州医科大学研究生院，贵州 贵阳 550004

2 贵州医科大学附属肿瘤医院肾内科，贵州 贵阳 550003

3 贵州医科大学附属肿瘤医院实验室，贵州 贵阳 550003

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管壁的主要结构成分，可调节血管张力，为血管壁结构提供主要支持，从而维持血管内压和组织灌注。VSMC与骨骼肌、心肌等其他类型的细胞不同，其具有较强的可塑性，在外界刺激下能够转换为未分化的合成表型，进而发挥增殖、迁移、合成细胞外基质的作用，这种可塑性可能会造成VSMC的异常增殖，这是血管增生性疾病发生的重要原因。自噬对于维持体内血管正常功能和结构具有重要作用，在生理状态下，VSMC通过增殖与自噬维持细胞数量的平衡，当平衡被打破，出现自噬过度激活或水平不足，均会引起VSMC的异常增殖，从而促进血管增生性疾病的进展。

1 VSMC的增殖

细胞增殖是生物体的重要生命特征，通过细胞分裂的方式产生新细胞，以补充体内衰老和死亡的细胞。但是，在许多病理情况下，外界环境造成某些细胞因子、生长因子增多，并且通过刺激信号转导调节某些基因的表达增多，使细胞增殖失控，从而引发疾病。VSMC的异常增殖已被证明在血管疾病的发生、发展中起着关键作用，是血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、脑梗死和动脉瘤等疾病发生的重要病理过程之一。

1.1 表型转化

VSMC是一种非终末分化的高度特异性细胞，具有可塑性，可以在两种表型之间进行转化，一种是静止的分化表型，又称收缩表型；一种是增殖的去分化表型，又称合成表型。收缩表型的VSMC主要发挥收缩血管和维持血管弹性的作用，其特点是细胞内肌丝丰富、收缩能力强，含有α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、平滑肌22α等特征性蛋白，几乎无增殖能力，主要参与维持动脉壁的机械性能[1]。合成表型的VSMC可大量合成和分泌细胞外基质，如基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9等活性物质，促使内皮细胞功能失调，诱导血管炎性改变，进而导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管重构、血管老化，引起终末器官血流灌注不足、功能异常甚至衰竭[2]。在正常的生理状态下，VSMC处于静止的收缩表型，当受到生长因子、细胞因子、炎性反应、机械刺激、缺氧、血管活性物质等因素刺激时，其从静止的收缩表型转变为高度迁移和增殖的合成表型，这个过程被称为表型转化。因此，VSMC的增殖与其表型转化密切相关，是增殖性血管疾病发展的重要原因。

1.2 细胞因子、生长因子及信号调控

当VSMC受到细胞因子、生长因子的刺激时，可通过表型转化促进VSMC的增殖。除此之外，细胞因子、生长因子可直接作用于VSMC膜受体，激活细胞内的信号转导通路，引起核内基因的表达，从而促使VSMC异常增殖。血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，是一种强效的促有丝分裂剂，通过影响多条下游信号通路刺激VSMC的增殖，包括Ras/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）等信号通路，这些信号通路均受蛋白酪氨酸磷酸酶的负性调控。成纤维细胞生长因子可以促进VSMC增殖，与PDGF具有部分相同的信号通路，如Ras/MAPK信号通路。表皮生长因子家族由多种肽类生长因子组成，具有促进VSMC增殖的作用；表皮生长因子影响的信号通路包括Ras/MAPK、PI3K/AKT、磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ，PLC-γ）和Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活因子信号通路等。尚茹茹等[3]通过体外分离培养大鼠主动脉的VSMC发现，给予胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）后，VSMC的活力增强，凋亡率明显下降。IGF-1/胰岛素相关途径刺激VSMC的增殖，IGF-1通过其受体和PI3K介导VSMC的促分裂作用。PI3K/AKT、细胞内磷脂酶A2、细胞外信号调节激酶1（extracellular signal-regulated kinase 1，ERK1）/细胞外信号调节激酶2（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2）在VSMC的增殖中亦具有重要作用。白细胞介素、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、钙及活性氧等炎性细胞因子通过影响细胞周期进程从而调控VSMC的增殖。

1.3 活性物质

血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的重要效应分子，其与血管紧张素受体结合，激活细胞内的信号转导通路，诱导免疫和炎性反应，进而刺激VSMC的增殖和迁移。Lin等[4]的研究发现，PI3K/AKT是血管紧张素受体的下游信号通路，其在细胞的迁移、增殖等过程中发挥了重要作用。有研究证实AngⅡ通过与血管紧张素受体结合后激活PI3K/AKT介导VSMC的增殖及迁移[5]。但是，可能有多种受体及信号通路参与了AngⅡ介导的VSMC增殖及迁移过程，机制较复杂，尚需要进一步的研究加以证实。内皮素-1是由血管内皮细胞分泌的血浆蛋白，具有较强的血管收缩活性。Tian等[6]通过体外培养大鼠VSMC，将培养的VSMC采用不同浓度的内皮素-1处理48 h后发现，其二氧化硫含量的荧光信号逐渐减弱，天门冬氨酸氨基转移酶的活性明显降低，增殖细胞核抗原表达和细胞增殖指数的上调，证实内皮素-1通过调节内源性二氧化硫/天门冬氨酸氨基转移酶途径参与VSMC的增殖和迁移过程。

2 VSMC的自噬

2.1 概念

自噬是指通过粗面内质网中无核糖体附着区脱落的双层膜结构，包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现某些细胞器的更新和细胞本身的代谢需要。除了消除细胞内聚集物和受损的细胞器，自噬还促进细胞衰老和细胞表面抗原呈递，防止基因组不稳定和坏死，使其在预防神经变性、糖尿病、恶性肿瘤、心肌病、肝病、自身免疫性疾病和感染性疾病等疾病中发挥关键作用[7]。自噬分为三种形式：微型自噬、分子伴侣介导的自噬和巨型自噬，其中，研究最充分的形式是巨型自噬。自噬还包括几种选择性形式，涉及不同细胞内物质的降解，如吞噬、有丝分裂吞噬、同源吞噬、网状吞噬、核吞噬和异源吞噬，分别是侵略体、线粒体、过氧化物酶体、内质网、核糖体及细菌和病毒降解的选择性途径。在饥饿、氧化应激和感染等刺激条件下，细胞信号通路、调节蛋白及复合物会被激活，从而加速自噬体膜的成核、延伸和成熟[8]。

2.2 自噬中的关键蛋白

微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是酵母中自噬相关蛋白-8分子在哺乳动物中的同源物之一，已被作为自噬的标志蛋白。LC3前体被自噬相关蛋白-4剪切变成LC3-Ⅰ，随后LC3-Ⅰ在自噬相关蛋白-7和自噬相关蛋白-3的作用下，经过一系列反应生成具有膜结合力的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ可以显示自噬水平的高低。Beclin1是细胞自噬的关键起始蛋白，主要与PI3K形成复合物，调节自噬相关蛋白在自噬前体中定位。p62是重要的自噬受体，在自噬过程中与泛素化的蛋白质结合，再与LC3-Ⅱ蛋白形成复合物，共同在自噬溶酶体内降解；相反，自噬抑制蛋白可以稳定p62蛋白水平。当自噬系统受损或自噬活性减弱时，p62蛋白会在细胞质中不断积累，因而p62也是反映自噬活性的重要标记蛋白之一。

2.3 自噬对VSMC的影响

自噬可能在不同条件下对VSMC产生不同的影响。自噬可由VSMC中的细胞因子调节，如TNF-α和IGF-1。TNF-α的作用是通过c-Jun氨基末端激酶和AKT途径诱导LC3 mRNA表达，通过c-Jun氨基末端激酶提高Beclin-1蛋白的表达水平，促进VSMC自噬。IGF-1通过AKT途径降低LC3 mRNA的表达水平，从而抑制VSMC自噬，促进细胞存活[9]。在体外研究中，骨桥蛋白诱导的自噬具有促进细胞凋亡或黏附的特性[10-11]。AngⅡ诱导的VSMC自噬可能在血管损伤的发病中发挥负性作用[12]。缺氧[13]、4-羟基壬烯醛[14]、1-棕榈酰-2-（5’-氧代戊酰）-sn-甘油-3-磷酸胆碱[15]、7-酮基胆固醇[16]激活自噬，能够促进内质网应激或线粒体功能障碍，保护VSMC免受凋亡。这些结果表明，在某些情况下，自噬不利于VSMC的存活，然而，自噬对VSMC亦具有保护作用。在VSMC中，自噬起到了关键作用，能够保护细胞免受凋亡，但过度的自噬或自噬的严重受损可能导致不可逆转的细胞衰老，进而加速血管疾病的进展。

3 自噬在VSMC增殖中的作用

自噬作为一种有助于细胞稳态的重要生物学过程，已被认为是VSMC存活的重要介质[17-18]。它保护细胞免受损伤，从而保护血管功能[19-20]。细胞的自噬具有两种截然相反的功能。在正常情况下，自噬可以抑制VSMC增殖，但当自噬被过度激活或者水平不足时，均能够引起VSMC的异常增殖[21]。另外，自噬还能够促进VSMC增殖，包括以下两种形式：（1）当外界刺激时，VSMC自噬水平升高，加速了蛋白质和细胞内细胞器降解的速度，促进了VSMC表型转化及增殖，从而促进了血管增生性疾病的发生；（2）在病理条件下，过度的氧化应激、胆固醇晶体堆积和其他刺激可以破坏溶酶体膜，从而破坏自噬过程，最终导致自噬缺陷[22-23]。VSMC自噬缺陷触发抗氧化反应，加速VSMC的迁移能力，促进损伤诱导的新生内膜形成。

3.1 自噬对细胞因子、生长因子诱导VSMC增殖的影响

VSMC中的PDGF是通过诱导Beclin1磷酸化及Ⅲ型PI3K与Beclin1相互作用，进而促进VSMC自噬，其表现为收缩蛋白如α-平滑肌肌动蛋白的丢失及合成蛋白如骨桥蛋白的增加，表明此种自噬与合成表型相关，从而得出PDGF诱导的自噬与VSMC的迁移和增殖能力增强有关。通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制PDGF诱导的自噬可以防止收缩表型的丧失，推测PDGF激活自噬程序可促进收缩蛋白的降解，从而使VSMC迅速达到合成状态[24]。TNF-α主要通过c-Jun氨基末端激酶、蛋白激酶B诱导的LC3 mRNA和c-Jun氨基末端激酶诱导的Beclin1，引起VSMC的自噬与凋亡，通过在体外培养大鼠动脉平滑肌细胞发现，自噬是TNF-α诱导VSMC表型转换的关键介质，抑制自噬可以阻止TNF-α诱导VSMC表型转换[25]。

3.2 自噬对AngⅡ促进VSMC增殖的影响

AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应激素。张紫微等[26]的研究发现AngⅡ以时间依赖的方式促进LC3-Ⅱ的表达，电镜下可观察到显著增加的自噬小体，且AngⅡ还上调了自噬相关蛋白-7的表达，以此证实AngⅡ可以促进VSMC发生自噬，随后使用3-甲基腺嘌呤抑制AngⅡ诱发的自噬，可以观察到收缩表型的标志蛋白明显增多，而合成表型的标志蛋白显著减少，则表明抑制自噬后可明显抑制AngⅡ促进的VSMC由收缩表型转换为合成表型的过程，从而抑制AngⅡ促进VSMC增殖、迁移等生物活性。

3.3 自噬对剪切应力诱导VSMC增殖的影响

血流作用于血管壁介导的机械应力主要包括3种：（1）垂直作用于管壁的血液压力；（2）跨壁压梯度造成血管壁被拉伸而产生的环形压力；（3）与管腔内表面的摩擦力，又称管壁剪切应力。在内皮细胞上，剪切应力可通过多条信号转导通路影响血管内皮细胞自噬，调节内皮功能。Sun等[27]的研究表明剪切应力可抑制VSMC中收缩基因的表达，有助于VSMC从收缩表型向合成表型的表型转换。同时，该研究中还在暴露于剪切应力培养的VSMC中观察到自噬水平增强，使用3-甲基腺嘌呤可以阻断异常剪切应力的促细胞表型转化作用，说明异常剪切应力诱导的自噬能够通过促进VSMC的表型转换，从而刺激VSMC的增殖。

4 影响VSMC增殖与自噬的药物

4.1 通过上调自噬水平影响VSMC增殖的药物

权彦等[28]通过原代培养大鼠胸主动脉VSMC，给予不同质量浓度的大黄素处理细胞后，观察到其对VSMC增殖和迁移的抑制作用逐渐增强，并且还观察到在不同质量浓度的大黄素抑制VSMC增殖和迁移的过程中，细胞自噬水平上调，为了进一步证实，采用3-甲基腺嘌呤抑制自噬，经3-甲基腺嘌呤预处理VSMC后，大黄素对VSMC增殖、迁移的抑制作用明显减弱，说明大黄素可通过诱导细胞自噬达到抗VSMC增殖的作用。Wu等[29]提出丹皮酚是从牡丹皮中提取的天然化合物，具有多种药性，在中药中应用广泛，丹皮酚通过在体内和体外激活腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，从而上调自噬水平来对抗VSMC增殖。钙通道阻滞剂具有降低血压的作用，也有助于抗增殖作用的发挥，在经过维拉帕米处理过的VSMC中，通过电子显微镜观察，线粒体结构完整性丧失，同时，维拉帕米诱导表达LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和自噬相关蛋白，通过定量LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值提示维拉帕米增强了自噬能力，表明钙通道阻滞剂通过上调自噬水平增加线粒体损伤，从而促进抗VSMC增殖的作用[30]。牟仁奎等[31]通过原代培养大鼠VSMC，加入鸢尾素孵育后，细胞上清液炎性因子的表达水平降低，VSMC增殖明显受到限制，同时还观察到腺苷酸活化蛋白激酶通路相关分子和蛋白及其磷酸化水平增加，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路相关分子和蛋白及其磷酸化水平下降，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的表达水平升高，p62的表达水平下降，证实了鸢尾素通过激活腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路上调VSMC的自噬水平从而抑制VSMC的增殖。

4.2 通过下调自噬水平影响VSMC增殖的药物

邱伟文等[32]的研究发现氧化低密度脂蛋白升高了VSMC中LC3和Beclin1的表达水平，而脑心通可抑制氧化低密度脂蛋白的表达从而诱导VSMC中Beclin1和LC3的表达水平升高，同时抑制了其对VSMC增殖的诱导。丁基苯酞通过阻断β-连环蛋白信号通路下调自噬水平，从而保护VSMC免受PDGF诱导的增殖[33]。朱焕勉等[34]通过培养大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用细胞自噬检测试剂盒进行荧光染色，结果显示，经低氧联合氯喹作用后，自噬空泡数量明显增加，说明氯喹抑制了低氧条件下自噬体的降解过程，自噬抑制剂氯喹可能通过抑制自噬体与溶酶体的融合，从而抑制降解过程，最终导致自噬空泡过度积聚，进而抑制自噬的进程，同时通过四甲基偶氮唑蓝细胞增殖实验结果表明，低氧与氯喹联合作用后明显抑制了细胞的增殖。说明氯喹能够抑制低氧引起的肺动脉平滑肌细胞自噬，进而抑制低氧引起肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的水平。

5 小结与展望

在VSMC的增殖中，VSMC显著的可塑性是最关键的因素，当受到生长因子、细胞因子等因素的刺激时，VSMC发生表型转换，从而发生增殖。除此之外，这些因子还可以直接作用于细胞膜受体，激活细胞内信号转导通路，最终导致核内基因的表达上调而促使VSMC异常增殖。自噬是维持内环境稳态的一种自我保护机制，其在VSMC中起到了关键作用，适度的自噬有利于VSMC的存活，保护细胞免受损伤，而过度激活的自噬或自噬严重受损均会引起细胞衰老，甚至凋亡。目前，关于VSMC中增殖与自噬的联系，已阐明了自噬参与一些生长因子、细胞因子、活性物质、剪切应力及信号通路诱导VSMC增殖的过程，自噬已被证实对于VSMC增殖的发生、发展具有关键作用。因此，可以将自噬在VSMC中的发生机制作为主要研究目的，寻找通过调控自噬水平治疗血管增生性疾病的方法。