单克隆抗体技术在畜禽疾病诊断中的应用

吴芷静

（辽宁省沈阳市沈北新区农业技术推广与行政执法中心 110000）

1975 年，Kohler 和Milstein 通过细胞杂交技术，利用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立起第一个B细胞杂交瘤株，并成功制备出抗绵羊红细胞的单克隆抗体，由此发现了可产生抗体的杂交瘤细胞。他们发现，杂交瘤细胞具有单一的特异性抗原识别位点，具有小鼠淋巴细胞的特性和骨髓瘤细胞持续增殖的能力[1]。单克隆抗体的识别性专一，只针对特定的抗原决定簇反应，大大提高了敏感性。杂交瘤细胞表达的是针对淋巴细胞的特异性抗体，以及其在组织培养中生长的骨髓瘤细胞的永生特征。重要的是，杂交瘤是单克隆的，因为培养的细胞起源于一个细胞。杂交瘤细胞可注射到组织相容性小鼠体内产生腹水细胞肿瘤，此方法成为高浓度单克隆抗体的来源，通过此方法产生的单克隆抗体可以在液氮中无限期冷冻，需要细胞时可以随时解冻并重新培养，继续生产相同的特异性抗体，产生的特异性抗体不会因批号不同产生差异，有利于诊断试剂标准化，也便于制备试剂盒。相对于其他生物学诊断方法，畜禽疾病诊断中单克隆抗体诊断技术具有更加特异、灵敏、成本更低的优点，而且随着生物技术手段的提高，单克隆抗体更易于生产出商品化的诊断试剂，目前胶体金试纸条的应用使得畜禽疾病诊断更加快速便捷。因此，单克隆抗体诊断方法具有广泛的应用前景[2]。

1 单克隆抗体的一般应用

单克隆抗体在生物医学领域一般用于鉴定蛋白质、碳水化合物和核酸等大分子物质。如今单克隆抗体可以用于细胞复制和分化领域，大大提高了我们对分子结构和功能之间的了解，在基础生物科学方面，提高了我们对宿主抵抗传染病和器官移植排斥反应的认识，同时也提高了人们对自发转化的细胞（肿瘤）及内源性抗原（参与自身免疫）的认识。

在兽医学中，单克隆抗体主要应用于3 个方面，即（1）免疫诊断试剂，直接作为证明病原体或间接用作血清学抗原致病因子的检测；（2）用于抗原表位的分子解析及疫苗的单克隆抗体的保护性免疫实验；（3）用于传染性疾病的免疫治疗方面或可作为定位和靶向肿瘤的工具[2]。

2 单克隆抗体在家畜疾病诊断中的应用

2.1 使用单克隆抗体诊断微生物疾病

布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌引起的以发热和流产为特征的人兽共患病，威胁着人类和多种动物的生命安全，对畜牧业造成巨大的经济损失[3]。牛布鲁氏菌病会导致怀孕后期的母牛流产，饮用感染牛乳汁的人群会感染该病。接种过疫苗的奶牛可能被诊断为布病是因为常规诊断方法无法区分病原微生物和由致病微生物制成的疫苗。单克隆抗体诊断法能高效、特异的检测出感染和免疫动物，使用该法可在发生疫情时快速隔离感染动物，减缓疫情的蔓延。单克隆抗体作为免疫组化法的抗体可以鉴别牛布鲁氏菌脂多糖表位：光滑菌株的A 和M 表位、粗糙菌株的R1 和R2 表位[4]。如今竞争ELISA 抗体检测法是一种成熟稳定的检测方法。将布氏菌抗原固定在酶标板后，待测血清和针对抗原表位的单克隆抗体进行共培养，当待检样品没有结合其他抗体时才能检测到单克隆抗体与酶标记抗原的结合，极大地提高检测效率。

副结核病（MAP）又称约内氏病，是一种由副结核分枝杆菌引起的以慢性增生性肠炎为特征的传染性疾病。副结核病给畜牧业造成了巨大的经济损失[5]。目前已产生对副结核杆菌分泌的重要蛋白即Ag85 复合物高度特异的单克隆抗体，单克隆抗体法与ELISA 法、粪便检查法相比具有较高的灵敏度和特异性，基于此法建立了血清库，可以快捷的区分MAP 阳性牛和阴性牛。

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体所引起的一种急性全身性感染性疾病，鼠类和猪是两大主要传染源，畜禽出现流产、死胎、不孕及产奶量减少等症状。目前已经报道了命名为M553 的鼠单克隆抗体，M553 单克隆抗体可与伯氏钩端螺旋体等螺旋体的表位共同抗原结合。与显微凝集试验(Matt) 相比，单抗-竞争ELISA 抗体检测法（cELISA）具有更好的应用价值[6]。

牛传染性胸膜肺炎（CBPP）是由丝状支原体引起的牛的一种高度接触性传染性疾病。Ayling 等(1998) 发现了M92/20单抗的间接免疫组化法(IHC) 诊断疑似感染CBPP 的病例的方法[7]。使用间接免疫组化法检查11 只感染CBPP 的牛肺，能检测到所有感染病例。这表明M 92/20 单抗的间接免疫组化检测法具有高灵敏度。

2.2 用于检测抗禽流感病毒的抗体

目前急需加强病毒感染诊断研究，建立国际病毒基础数据库，方便诊断和遏制病毒性疾病在全球的蔓延。在病毒感染检测方面，单克隆抗体的诊断发挥了关键作用。

口蹄疫（FMD）是猪、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，并被世界动物卫生组织（OIE）列为A 类传染病之首[8]。被公认为是十六世纪以来威胁养牛业的重大疾病之一，在印度，每年约有5000 起疫情，对养殖业造成巨大的经济损失。因此，采用单克隆抗体高效快速诊断口蹄疫疫情可以减少畜牧业损失。单克隆抗体的流行诊断装置（LFD）对7 种FMDV 血清型反应，能快速诊断不同血清型的口蹄疫，为早期实施控制措施预留时间，减少FMD 的快速传播。在目前临床诊断上，针对FMD 已开发出快速色谱条测试。另外，临床上还开发了基于单克隆抗体技术的胶体金免疫层析试纸条检测方法，试纸法可以在野外简单快速地检测A 型口蹄疫病毒，具有较高的灵敏度和特异性[9]。

牛传染性鼻气管炎（IBR）是由牛疱疹病毒1（BoHV-1）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。该病以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征[10]。通过BoHV-1单克隆抗体中和病毒上清液可以用于鉴定牛传染性鼻气管炎。

蓝舌病毒（BTV）属于呼肠弧病毒科中环状病毒，目前已被广泛研究。从病毒血清分组看，存在于BTV 病毒核衣壳外层的VP2 蛋白质参与病毒复制，是蓝舌病毒重要的组成部分。目前已经生产了几种单克隆抗体来鉴定VP2 蛋白上的特异性表位[11]。此外，存在少量病毒外层中的VP7 蛋白可从病毒外表面获得，并且可靶向检测BTV。

狂犬病是一种是由狂犬病病毒引起的、影响温血动物的急性病毒性脑脊髓炎。尽管狂犬病病毒糖蛋白上抗原位点的数量随时间推移而有规律的增加，早期试验可以根据中和抗性变异狂犬病毒的分组确定至少3 个功能独立的抗原位点。但Benmansour[12]等通过使用250 多个新分离的单克隆抗体对H-2d 单体型小鼠中蛋白质抗原性进行了特异性检测。

2.3 用于诊断寄生虫病

旋毛虫病是在动物与人之间传播的人兽共患病[13]。单克隆抗体在旋毛虫病早期诊断中极具意义，基于IgY（蛋黄免疫球蛋白）和针对排泄分泌抗原（IgM 型）的抗旋毛虫肌幼虫的单抗-夹心ELISA 法已经用于检测血清中的循环抗原（CAg），该方法使用鸡抗体IgY 作为捕获抗体和小鼠单克隆抗体35B9 作为检测抗体，能检测到加入正常小鼠血清中浓度低至1ng/ml的排泄分泌抗原，显示出高灵敏度。此外，它对旋毛虫病的早期诊断和疗效评价具有一定的应用价值，这种以IgM 为基础的单克隆抗体检测可以作为检测旋毛虫抗体的补充方法[14]。

锥虫病是由锥虫感染所致的原虫感染性疾病，该病在家畜中普遍存在、分布广泛，是世界动物卫生组织列出的疾病之一。针对布氏锥虫，刚果锥虫、伊氏锥虫开发的特异性单克隆抗体可用于间接ELISA 中的特定抗原分离和纯化。

利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起一系列的疾病：从黏膜皮肤利什曼病到致命的利什曼病（VL）。不同种类利什曼原虫特异性的单克隆抗体已被用于诊断利什曼原虫虫株。目前单克隆抗体可以分离并纯化利什曼病抗原。针对印度杜氏利什曼原虫的致病性前鞭毛体产生的单克隆抗体已用于免疫亲和纯化利什曼原虫无鞭毛体和前鞭毛体中的78kDa 膜蛋白和识别子代利什曼原虫的57kDa 抗原[15]。

恶性疟原虫入侵红细胞需要运动连接的形成：运动连接复合物由在疟原虫表面的微线体蛋白（AMA）和疟原虫释放后识别，并嵌入到宿主细胞膜的棒状体颈蛋白（RONs），该复合物以AMA1-RON2 为骨架。PfAMA1 的结构研究表明，其在顶端存在保守的疏水区，协调RON2 和入侵的抑制肽。单克隆抗体与AMA1 疏水区特异结合后阻止运动连接的形成和诱导纳虫空泡的形成。根据结合在AMA1 疏水区附近的单克隆抗体，可以鉴定RON2 的结合位点，为潜在疟疾疫苗提供新的靶点[16]。

3 结论

生物技术的进步有利于单克隆抗体的大规模批量生产，单克隆抗体可运用于多种疾病临床诊断，如使用免疫荧光和ELISA 等方法检测感染性病原体、抗原或对抗原感染产生的抗体。本综述中讨论的许多重要牲畜禽疾病的诊断方法将方便诊断人员和研究人员加强对疾病快速诊断的认识，为控制疾病提供更多、更好的选择。