miR-204-5p对口腔鳞状细胞癌生物活性和Fas、Ki67基因的作用及机制

华永晴 南欣荣，2 张海峰

(山西医科大学 1第一医院口腔科，山西 太原 030001；2口腔医学院)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势〔1，2〕。吸烟、饮酒、无烟烟草及人乳头瘤病毒感染均是诱发OSCC的危险因素。OSCC组织发生部位相对特殊，恶性程度高，浸润性强，易发生区域淋巴结转移或远处转移，且预后较差〔2〕。由于OSCC发病不明显，当患者就诊时50%以上患者已经处于晚期，尽管近年来肿瘤的诊断和治疗方面已经取得很大的进步，外科手术及术后放、化疗仍然是其常规治疗手段，但OSCC预后仍未见明显改善。微小RNA(miRNA)是一种长度为22 nt的小分子非编码RNA，其广泛存在于真核生物中，miRNA能对下游的靶基因mRNA的3′端非翻译区(3′URT)进行特异性识别，还能和3′URT相结合进而促进mRNA的降解，最后完成对靶基因的翻译过程进行抑制〔3〕。研究发现miRNA参与肿瘤的发生发展，其还可以作为肿瘤的抑癌和致癌因子，进而参与肿瘤的生长、分化、增殖和凋亡等〔4〕。有报道证实，在OSCC的发生发展中有多种不同的miRNA参与，其对癌细胞能进行有效的抑制，且在多种癌症中呈低表达〔5〕，但miRNA对OSCC的作用机制还没有明确的报道。Ki67基因和周期密切相关，Ki67也是细胞增殖基因中的一种，其随着细胞的增殖而高表达〔6〕。抑癌基因自杀相关因子(Fas)为非特异性抗原分子，广泛存在于各种组织器官中，如肾上腺、肾脏、肝脏、心脏、肺等〔7〕。有临床报道，在肺癌的发生发展中，Fas的基因表达明显下调〔8〕。研究发现，Ki67和Fas基因与口腔淋巴组织内淋巴结转移有关〔9〕，但具体的表达尚不清楚。目前，关于miR-204-5p对Ki67及FasL的作用机制尚未见研究报告，因此本文旨在探究miR-204-5p对OSCC生物活性的作用及机制，并分析其对Fas和Ki67基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1实验细胞 本实验所用的两种细胞均从中国科学院上海细胞库购买，分别为正常口腔上皮细胞系HIOEC，人OSCC细胞系CAL27。

1.2试剂和仪器 本实验所有试剂和仪器分别为美国sigma公司生产的链霉素、DMEM培养基、青霉素、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)；上海生工公司生产的Fas基因和Ki67基因；上海吉玛制药技术有限公司合成的miR-204-5p模拟物(mimic)和阴性(NC)对照模拟物；美国BD公司生产的Transwell试剂盒；东仁化学科技公司生产的CCK-8试剂盒；大连宝生物工程有限公司生产的实时荧光定量PCR分子试剂。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 复苏人正常口腔上皮细胞系HIOEC和人OSCC细胞系CAL27，转入加有15%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，加入100 μg/ml的链霉素和100 μg/ml的青霉素以防止细菌污染，于CO2培养箱中进行传代培养，要求培养箱中CO2含量为5%，温度为37℃，所有操作在无菌条件下进行。每1～2 d换液一次，细胞单层贴壁生长，待长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，选取进入对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2细胞转染 将培养至对数生长期的OSCC细胞系CAL27，采用0.25%胰蛋白酶消化后接种于6孔细胞板中，待细胞融合度至80%～90%时，更换为无血清DMEM培养基，采用LipofectamineTM2000法进行转染，严格按照试剂盒说明书进行操作。实验分为3组，空白组：CAL27细胞不转染序列，正常培养；阴性对照组(NC组)：CAL27细胞转染阴性对照序列进行培养；miR-204-5p组：把miR-204-5p mimic转染至人OSCC细胞系CAL27中进行培养。

1.4qRT-PCR检测miR-204-5p mRNA表达 分别取出HIOEC细胞和CAL27细胞，在两组细胞中加入裂解液后对细胞总RNA进行提取，逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，在95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共循环40个，4℃环境中保存。取平均值后得到Ct值，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列：miR-204-5p正义链5′-GCACAATCAAGTCTAAACTGGAG-3′,反义链5′-TCATGGTCAGGAGGGTTGTA-3′；GAPDH正义链5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3′，反义链5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。

1.5CCK-8检测细胞增殖 取对数生长期的CAL27细胞，胰酶消化成悬浮细胞，以每孔4×103个细胞传到96孔板中，培养24 h、48 h、72 h和96 h后对相应细胞进行转染后，根据试剂说明书每孔加入10 μl CCK8试剂。培养箱中孵育2 h后，在酶标仪490 nm波长下检测各孔吸光度A值，计算细胞生长速度(增殖倍数=细胞吸光度/0 h细胞吸光度)。

1.6Transwell小室检测细胞侵袭 将CAL27细胞在无血清的培养基中培养24 h，消化细胞，去除培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，调整细胞密度至3×105。接种到基质胶预处理的Transwell小室中。小室上层加人不含血清的培养基，下室加入含血清的培养基。在37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，去除上室中的培养基，用棉签擦去上层细胞，下层细胞结晶紫染色。每组随机选取5个视野对染色细胞进行细胞计数并照相。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡情况 取干预后的3组CAL27细胞，所有细胞离心后进行收集处理，分别把100 μl结合缓冲液重悬细胞，5 μl膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)和5 μl的碘化丙啶(PI)溶液加入其中，把所有的溶液全部混匀后进行孵育，15 min后把400 μl结合缓冲液重悬细胞加入其中，最后用流式细胞仪对肺癌细胞的凋亡情况进行检测。

1.8Western印迹检测Fas和Ki67蛋白表达 取3组CAL27细胞，提取细胞中的蛋白，BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度，取60 μg上样蛋白至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分离，转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗液中4℃摇床过夜，洗膜缓冲液洗3次，5 min/次；加二抗，室温摇床上孵育2 h，洗膜缓冲液洗3次，5 min/次。加显影液，显影并拍照，使用Image Lab软件分析目的蛋白的灰度值，得出相对表达量。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1HIOEC和CAL27细胞中miR-204-5p mRNA表达比较 和人正常口腔上皮细胞系HIOEC相比，人OSCC细胞系CAL27中miR-204-5p mRNA表达显著降低(1.00±0.11 vs 0.52±0.21;t=6.403,P<0.001)。

2.23组CAL27细胞中miR-204-5p mRNA表达比较 空白组和NC组中miR-204-5p mRNA表达无显著差异(P>0.05)；miR-204-5p 组和NC组、空白组相比miR-204-5p mRNA表达明显增多(P<0.05)，说明转染成功，见表1。

表1 各组细胞中miR-204-5p mRNA表达及细胞侵袭数比较

2.33组CAL27细胞侵袭能力比较 空白组和NC组细胞的侵袭数量无明显差异(P>0.05)；miR-204-5p组与NC组、空白组相比，细胞侵袭数量得到显著抑制(P<0.05)，见表1、图1。

2.43组CAL27细胞增殖能力比较 24 h各组细胞增殖情况无明显差异(P>0.05)，48、72、96 h空白组和NC组细胞的增殖能力没有显著的差异性(P>0.05)；与空白组、NC组相比，miR-204-5p组口腔鳞状细胞癌CAL27的增殖能力显著降低(均P<0.05)，见表2。

表2 各组不同时间细胞增殖能力比较

2.53组CAL27细胞凋亡能力比较 空白组和NC组人口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27凋亡率无显著差异(P>0.05)；与空白组、NC组相比较，miR-204-5p组细胞凋亡能力显著增加(P<0.05)，见表3、图2。

2.6Fas和Ki67蛋白表达比较 空白组和NC组CAL27细胞中Fas和Ki67蛋白表达无显著差异(P>0.05)；与NC组及空白组相比较，miR-204-5p组中Fas蛋白表达显著升高，Ki67蛋白表达得到明显抑制(P<0.05)，见表3、图3。

表3 各组细胞凋亡率、Fas蛋白和Ki67蛋白表达比较

3 讨 论

OSCC是一种极其复杂的疾病，其是机体通过自身及外界因素的诱导，对局部组织细胞致癌因子的发挥进行促进，让其失去正常的调控能力，进而导致细胞发生异常增生，形成没有用的物质；OSCC与基因突变、表观遗传学改变、染色体异位、缺失及扩增有关。既往关于癌症的焦点一直集中于蛋白编码基因，而近年来研究发现基因转录组中只有34%的是蛋白编码基因，而高达66%的是非编码基因，包括长链非编码RNA，反义RNA及miRNA，这些非编码RNA同样在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。学者研究发现，miRNA的异常改变与肿瘤的发生发展密切相关，在此过程中miRNA充当癌基因或抑癌基因〔11〕。其中miR-204-5p被认为是一个抑癌基因，在多种肿瘤中发挥关键作用。miR-204-5p主要通过作用于下游的靶基因抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，增加药物的敏感性，且miR-204-5p在多种实体肿瘤中低表达，并与患者的临床分期、淋巴结转移及不良预后相关〔12〕。本研究结果显示，和人正常口腔上皮细胞系HIOEC相比，OSCC中miR-204-5p mRNA明显减少，可见其在OSCC中呈低表达。OSCC细胞增殖能力是决定其生长速度的重要因素之一，细胞侵袭能力是反映肿瘤细胞转移潜能的重要指标〔13〕。本研究结果显示，miR-204-5p干预后的OSCC的增殖和侵袭能力均受到了明显的抑制，并且促进了OSCC细胞的凋亡，可见miR-204-5p能有效抑制OSCC的增殖和侵袭能力，同时促肿瘤细胞凋亡。Yin等〔14〕研究发现，miR-204-5p可有效抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭能力，其作用机制可能是通过下调RAB22A表达来发挥作用，进而增加miR-204-5p化疗的敏感性。Wang等〔15〕实验结果显示，miR-204-5p可抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力，其作用机制是通过调控表皮生长因子受体(EGFR)来实现。

Fas基因的编码产物是FasL的受体，能够在细胞内招募Fas死亡结构域相关蛋白(FADD)并介导死亡受体途径的细胞凋亡〔16〕。有临床研究报道，在胃癌的发生发展中，Fas基因表达明显下调；也有基础实验研究表明，抑制Fas表达能够阻碍胃癌细胞的凋亡〔17〕。本文结果显示Fas在口腔鳞状细胞癌中呈低表达，转染后的miR-204-5p组中Fas表达显著升高。张薇〔18〕研究发现，OSCC FasL表达阳性组癌细胞细胞凋亡指数明显低于FasL表达阴性组，OSCC Fas、FasL的表达与其形成有密切关系。Ki67是在于细胞增殖周期内的一种非蛋白性核蛋白，是一种增殖标记物〔19〕。Ki67蛋白在大多数良恶性肿瘤中高表达，被认为确定恶性肿瘤侵袭的一个有用的分子生物工具。Ki67蛋白表达在头颈部肿瘤中已被描述为一个可靠的预后因素。Ki67是人类所有增生细胞中普遍存在的肿瘤标志性抗原，提示细胞有丝分裂的过度增殖是肿瘤恶变程度的关键环节，Ki67蛋白过表达可反映细胞增殖速度及活性程度，对良恶性肿瘤的鉴别具有重要的临床意义。本研究结果显示，在OSCC中Ki67蛋白表达明显升高，miR-204-5p干预后发现Ki67表达得到了显著的抑制，可见miR-204-5p能有效抑制OSCC中Ki67表达。刘冰华〔20〕研究发现，不论是血管内皮生长因子(VEGF)-C还是Ki67，其癌组织中淋巴管密度、阳性表达率及淋巴结转移癌灶中淋巴管密度及阳性表达率均显著高于相应的正常组织，证实了VEGF-C和Ki67的表达可能与口腔淋巴癌组织内淋巴管生成和淋巴结转移有关。

本实验证实miR-204-5p可有效抑制口腔鳞状细胞癌的增殖和侵袭，促进其凋亡，其作用机制可能与促进Fas表达、抑制Ki67的活性有关，进而发挥改善OSCC生物学活性的作用。本实验存在一定的不足，未加入药物对照组，对于miR-204-5p、Ki67、Fas三者的关系未给出明确的实验说明，在今天的实验中，会加入更多研究方法，为OSCC的靶向治疗提供参考。