miR-374b-5p靶向VEGFC对肺癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响

赵丽霞 任成波 翟明慧 鲍昕 刘博 赵峻峰

(河北北方学院附属第一医院 1肿瘤内科，河北 张家口 075000；2放疗科；3病理科)

肺癌是一种发病率与死亡率均位居首位的恶性肿瘤〔1〕，因其高转移、高侵袭和放化疗不敏感等因素使目前常用的手术、放化疗等疗效并不理想〔2〕。因此，深入研究肺癌细胞转移和侵袭的分子机制，寻找有效抑制其发生的潜在治疗靶点，一直是肺癌基础研究的热点。研究显示，肺癌中存在多种异常表达的微小RNA(miRNA)，而这些miRNAs可能通过调控细胞迁移和侵袭等参与肺癌的恶性发展〔3〕。上皮-间质转化(EMT)是特定环境下上皮细胞向间质细胞转化的一种现象，是细胞获得转移和入侵能力的重要因素，与包括肺癌在内的多种肿瘤的恶性发展密切相关〔4〕。近年来，有研究发现微小RNA-374b-5p(miR-374b-5p)在膀胱癌和卵巢癌等组织中异常低表达，且可通过靶向锌指E盒结合的同源盒蛋白(ZEB)2或者叉头框蛋白(FOX)P1调控细胞迁移、侵袭和EMT，发挥着重要的抑癌作用〔5,6〕；但miR-374b-5p在肺癌细胞迁移、侵袭和EMT中的作用机制并不完全清楚。本研究通过生物信息学软件预测发现，血管内皮生长因子(VEGF)C可能是miR-374b-5p的潜在靶基因。VEGFC是血管内皮生长因子家族的成员，不仅在血管生成和调节血管通透性方面发挥着重要作用，其异常高表达还与肺癌细胞转移和EMT有关〔7,8〕；而VEGFC和miR-374b-5p在肺癌中是否存在着靶向调控关系并不清楚。本研究通过观察miR-374b-5p和VEGFC在肺癌细胞中表达情况，分析miR-374b-5p可否通过靶向调控VEGFC影响肺癌细胞迁移、侵袭和EMT。

1 材料与方法

1.1实验细胞、试剂和仪器 人支气管上皮BEAS-2B细胞(批号：CBP60577)和肺癌A549细胞(批号：CBP60084)、H1299细胞(批号：CBP60053)、H358细胞(批号：CBP60136)均购自南京科佰生物科技有限公司。Ham F-12K完全培养基(含10%胎牛血清，批号：MPM150910B)和BEAS-2B细胞专用培养基(批号：MCM-0496)购自宁波明舟生物科技有限公司；RPMI1640培养基(批号：E600028)、胎牛血清(批号：E510008)、LipoHigh脂质体高效转染试剂(批号：E607403)、总RNA提取试剂(批号：B511311)、通用总蛋白提取试剂盒(批号：C006225)、miRNA荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(批号：B532461)购自上海生工生物工程股份有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号：D0010)购自北京索莱宝生物科技有限公司；VEGFC抗体(批号：ab83905)、E-钙黏蛋白(cadherin)抗体(批号：ab1416)、N-cadherin抗体(批号：ab245117)、波形蛋白(Vimentin)抗体(批号：ab137321)、β-肌动蛋白(actin)抗体(批号：ab8227)购自美国Abcam公司；鼠抗人二抗(批号：MB009)购自上海中科英沐生物科技有限公司；miR-374b-5p mimics、mimics-NC和pcDNA3.1-VEGFC过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。CO2培养箱(型号：BPN-40RHP)购自上海一恒科学仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪(型号：LightCycler 480 Ⅱ)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；显微镜(型号：LV100N POL)购自日本尼康公司；Transwell小室(型号：3401)购自北京优尼康生物科技有限公司；凝胶成像系统(型号：ChemiScope 6000)购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2细胞培养 以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养H1299细胞和H358细胞，Ham′s F-12K完全培养基培养A549细胞，BEAS-2B细胞专用培养基培养BEAS-2B细胞，均在5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱内常规培养。

1.3实时荧光定量PCR检测miR-374b-5p表达水平 参照总RNA提取试剂使用说明书提取A549、H1299、H358和BEAS-2B细胞总RNA，定量后将RNA逆转录合成cDNA；再将cDNA作为模板，参照miRNA荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，采用2-ΔΔCt法计算miR-374b-5p表达水平。其中，每种细胞设3个重复。扩增程序如下：94℃ 240 s；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环；72℃ 360 s。引物由北京索莱宝生物科技有限公司合成。引物序列为：内参U6上游5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′，下游5′-GTACAACACATTGTT TCCTCGGA-3′；miR-374b-5p上游5′-TCAGCGGA TATAATACAACCTGC-3′，下游5′-TATCGTTGTTCT CCACTCCTTCAC-3′。实验重复3次。

1.4细胞转染 将对数生长期的H1299细胞按照每孔2.5×105个接种至6孔板上，常规培养贴壁后，参照LipoHigh脂质体高效转染试剂使用说明书将miR-374b-5p mimics转染至H1299细胞中作为mimics组，将mimics-NC转染至H1299细胞中作为NC组，将miR-374b-5p mimics和pcDNA3.1-VEGFC共转染至H1299细胞中作为mimics+VEGFC组，将miR-374b-5p mimics和pcDNA3.1共转染至H1299细胞中作为mimics+pcDNA3.1组，并将未做转染的H1299细胞作为对照组。其中，每组设置3个平行。在转染5 h时，更换新鲜培养液，再继续培养48 h。

1.5双荧光素酶报告基因实验检测miR-374b-5p和VEGFC的靶向关系 采用TargetScan和miRDB数据库软件预测miR-374b-5p和VEGFC之间的结合位点，对结合位点序列及定点突变后的序列克隆扩增后插入pGL3-Basic载体上，分别构建VEGFC野生型质粒(VEGFC-Wt)和VEGFC突变型质粒(VEGFC-Mut)；将miR-374b-5p mimics及mimics-NC分别与VEGFC-Wt、VEGFC-Mut共转染至H1299细胞中，其中每组设3个复孔；在转染48 h后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测H1299细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

1.6划痕实验检测细胞迁移 首先，以Maker在6孔板背面过孔画横线，每孔加入106个H1299细胞，分为NC组、mimics组、mimics+pcDNA3.1组和mimics+VEGFC组，按照1.4中方法转染后，采用小号枪头垂直横线划痕；将划下的细胞除去后，加入无血清培养基继续培养；分别在培养0、48 h于显微镜下拍照观察，并计算各组H1299细胞的划痕愈合率。其中，划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.7Transwell小室检测细胞侵袭 收集转染48 h后的NC组、mimics组、mimics+pcDNA3.1组和mimics+VEGFC组H1299细胞，以无血清培养基制成浓度为105个/ml的细胞悬液；在基质胶包被的Transwell小室上室每孔接种200 μl H1299细胞悬液，在小室下室每孔接种600 μl含胎牛血清的培养基；常规培养48 h后取出小室；经甲醇固定20 min后，加入0.5%结晶紫染色15 min；在显微镜下观察拍照分析。实验重复3次。

1.8Western印迹检测VEGFC、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平 参照通用总蛋白提取试剂盒说明书提取待测细胞总蛋白后，采用二奎啉甲酸法对总蛋白进行定量；将变性后的蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，湿转法转至聚偏氟乙烯膜上；封闭1 h后，加入特异性一抗VEGFC(1∶2 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶2 000)和β-actin(1∶2 000)室温孵育2 h；再经二抗(1∶5 000)室温孵育2 h后，显影液显影；β-actin作为内参，Image J软件分析VEGFC、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。实验重复3次。

1.9统计学分析 采用SPSS24.0软件行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-374b-5p和VEGFC蛋白在肺癌细胞中的表达差异 实时荧光定量PCR和Western印迹检测结果显示，与人支气管上皮BEAS-2B细胞相比，人肺癌A549、H1299、H358细胞中miR-374b-5p表达水平明显降低，而VEGFC蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，且miR-374b-5p和VEGFC蛋白表达水平在H1299细胞中变化最显著(P<0.05)。见图1、表1。

表1 miR-374b-5p和VEGFC蛋白在不同细胞系中的表达水平

2.2miR-374b-5p和VEGFC的靶向关系 采用TargetScan和miRDB软件预测发现，miR-374b-5p与VEGFC之间存在互补的结合位点，见图2。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与mimics-NC组比较，miR-374b-5p mimics组转染VEGFC-Wt的H1299细胞荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，但miR-374b-5p mimics组转染VEGFC-Mut的H1299细胞荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。见表2。

表2 两组H1299细胞的荧光素酶活性

2.3转染miR-374b-5p mimics后肺癌H1299细胞中miR-374b-5p表达水平 实时荧光定量PCR检测结果显示，与对照组(1.00±0.00)比较，NC组H1299细胞中miR-374b-5p表达水平(0.95±0.08)差异无统计学意义(P>0.05)；与NC组比较，mimics组H1299细胞中miR-374b-5p表达水平(20.16±2.35)明显升高(P<0.05)。

2.4miR-374b-5p过表达对肺癌H1299细胞中VEGFC蛋白表达的影响 Western印迹检测结果显示，与NC组比较，mimics组H1299细胞中VEGFC蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与mimics组比较，mimics+pcDNA3.1组H1299细胞中VEGFC蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但mimics+VEGFC组H1299细胞中VEGFC蛋白表达水平较mimics+pcDNA3.1组明显升高(P<0.05)。见图3、表3。

表3 转染后各组H1299细胞中VEGFC蛋白表达水平、细胞迁移及侵袭能力比较

2.5miR-374b-5p过表达靶向调控VEGFC对肺癌H1299细胞迁移的影响 划痕实验检测结果显示，与NC组比较，mimics组H1299细胞迁移能力明显减弱(P<0.05)；与mimics组比较，mimics+pcDNA3.1组H1299细胞迁移能力差异无统计学意义(P>0.05)，但mimics+VEGFC组H1299细胞迁移能力较mimics+pcDNA3.1组明显增强(P<0.05)。见表3、图4。

2.6miR-374b-5p过表达靶向调控VEGFC对肺癌H1299细胞侵袭的影响 Transwell小室实验检测结果显示，与NC组比较，mimics组H1299细胞侵袭能力明显减弱(P<0.05)；与mimics组比较，mimics+pcDNA3.1组H1299细胞侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)，但mimics+VEGFC组H1299细胞侵袭能力较mimics+pcDNA3.1组明显增强(P<0.05)。见表3、图5。

2.7miR-374b-5p过表达靶向调控VEGFC表达对肺癌H1299细胞EMT的影响 Western印迹检测结果显示，与NC组比较，mimics组H1299细胞中EMT上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平明显升高，而间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与mimics组比较，mimics+pcDNA3.1组H1299细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与mimics+pcDNA3.1组比较，mimics+VEGFC组H1299细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低，而N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图6、表4。

表4 各组H1299细胞中EMT相关蛋白表达水平的比较

3 讨 论

miRNAs是一类较短的内源性非编码RNA，可通过与靶基因mRNA特异性结合引起mRNA降解或抑制其翻译来影响基因表达，在包括肺癌在内的多种肿瘤细胞增殖、分化、侵袭和迁移等过程中发挥着重要的调控作用〔9，10〕。miR-374b-5p是miRNAs中的一员，其异常表达可通过靶向调控生长抑制因子(ING)1、三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运蛋白家族A亚家族成员(ABCA)8和FOXP1参与乳腺癌、肝癌和卵巢癌等肿瘤细胞侵袭、迁移〔6，11，12〕；另外，miR-374b-5p过表达还可通过靶向下调ZEB2抑制膀胱癌细胞EMT能力〔5〕。尽管已有学者指出，miR-374b-5p在肺癌组织中低表达，且其过表达可通过靶向富含丝氨酸/精氨酸剪接因子(SRSF)7抑制H460细胞及H661细胞迁移和侵袭〔13〕；但其对肺癌细胞EMT的影响未见报道；同时，miR-374b-5p是否还通过调控其他基因发挥抗肿瘤作用也有待探讨。

肿瘤转移是导致治疗失败的重要原因，而淋巴道转移是肿瘤细胞转移的重要途径〔14〕；VEGFC是一种在淋巴血管发育过程中发挥重要作用的调节因子，其异常表达与宫颈癌、胶质瘤、前列腺癌和肝内胆管癌等多种肿瘤细胞迁移、侵袭和EMT密切相关〔15～18〕。有研究报道，VEGFC在肺癌常见类型非小细胞肺癌组织中呈现高表达〔19〕，且VEGFC表达下调是拓扑替康抑制肺癌细胞转移的重要机制〔20〕。然而，VEGFC在肺癌细胞中的表达及对细胞迁移、侵袭和EMT的影响并不清楚。本研究结果提示，miR-374b-5p和VEGFC可能在肺癌发生发展过程中发挥着重要作用，VEGFC是miR-374b-5p的靶基因，miR-374b-5p过表达可通过靶向下调VEGFC表达抑制肺癌H1299细胞迁移、侵袭和EMT发生。

综上，在肺癌细胞中miR-374b-5p表达降低，而VEGFC蛋白表达升高，本研究首次揭示了miR-374b-5p抑制肺癌H1299细胞迁移、侵袭和EMT是通过靶向下调VEGFC表达来实现的。该结果局限于细胞水平和单一细胞株，后期还需在体内动物实验和其他肺癌细胞株中进行验证。