黑苏嘎-25对缺氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡及炎症反应的影响

包春生 高玉峰

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000)

缺血性脑卒中发病率逐年上升，已严重影响患者生活质量，目前缺血性脑卒中的发病机制尚未阐明，已知神经干细胞(NSCs)损伤与缺血性脑卒中的发生密切相关，其中NSCs存在于神经系统中并可定向分化为神经元、星形胶质细胞等，因而促进NSCs增殖及分化成为治疗缺血性脑卒中的关键措施，既往研究显示部分植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用，并可减轻神经元细胞损伤，但关于其具体作用机制尚未阐明〔1～4〕。黑苏嘎-25主要成分为麝香、木香等，其主要是从天然产物中提取，并可减轻脑缺血损伤〔5〕。但黑苏嘎-25对NSCs细胞损伤的作用机制尚未阐明。缝隙连接蛋白(Cx)43主要存在于星形胶质细胞中，抑制Cx43表达可缩小脑梗死面积〔6〕。但黑苏嘎-25对NSCs细胞损伤及Cx43表达的影响尚未阐明。因此，本研究采用缺氧诱导的神经干细胞建立细胞损伤模型，探讨黑苏嘎-25对缺氧诱导的神经干细胞增殖、凋亡及炎症反应的影响，探究其对Cx43的表达及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 小鼠神经干细胞C17.2购自上海雅吉生物科技有限公司；黑苏嘎-25购自内蒙古民族大学附属医院制剂室生产(0.2 g/粒)；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；噻唑蓝(MTT)试剂购自上海信帆生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒购自苏州宇恒生物科技有限公司；白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司；兔抗鼠细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠Cx43抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组 神经干细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，将其置于缺氧装置(37℃、1%O2、体积分数5%CO2培养箱)内分别培养6、12、24 h〔7〕，分别记为6、12、24 h缺氧组。同时将正常培养的细胞作为NC组。神经干细胞(1.5×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，分别加入含不同浓度(0.03、0.10、0.30、0.90、1.80、3.60 mg/ml)黑苏嘎-25的培养液培养24 h〔8〕，然后置于缺氧装置(37℃、1%O2、体积分数5%CO2培养箱)内培养12 h，分别记为0.03 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组、0.10 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组、0.30 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组、0.90 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组、3.60 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组。

1.2.2MTT检测细胞增殖 取神经干细胞(1.5×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)后按照“1.2.1”分组处理，分别加入MTT溶液(20 μl/孔)后继续培养4 h，3 000 r/min转速离心5 min后弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO，150 μl/孔)，应用酶标仪检测各组细胞相对吸光度值(A值)。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组神经干细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，按照凋亡试剂盒说明书操作并检测各组细胞凋亡率。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、TNF-α的水平 取各组神经干细胞培养液，采用ELISA检测IL-6、TNF-α的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5Western印迹检测CyclinD1、Bcl-2、Bax、Cx43蛋白表达 各组神经干细胞加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)反应，分离的蛋白凝胶被转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉被用于封闭2 h，加入一抗稀释液(1∶1 000)后放入4℃冰箱内孵育24 h，采用TBST洗涤后加入二抗稀释液(1∶2 000)，将其放入室温条件下孵育1 h后使用TBST洗涤，滴加ECL后置于暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1缺氧处理不同时间NSCs细胞活性的变化情况 与NC组(0.963±0.09)比较，6 h缺氧组(0.824±0.08)、12 h缺氧组(0.546±0.05)、24 h缺氧组(0.497±0.04)A值明显降低(P<0.05)，其中缺氧处理12 h后细胞活力趋于50%，因而选用缺氧处理12 h进行后续实验。

2.2缺氧处理不同时间NSCs细胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达 与NC组比较，6、12、24 h缺氧组CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western印迹检测检测CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的相对表达量

表1 缺氧处理不同时间NSCs细胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.3不同浓度黑苏嘎-25对缺氧处理的NSCs细胞增殖活性的影响 与NC组(0.972±0.09)比较，12 h缺氧组(0.539±0.05)A值明显降低(P<0.05)；与12 h缺氧组比较，0.10 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组(0.573±0.05)、0.30 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组(0.643±0.07)、0.90 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组(0.782±0.07)、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组(0.902±0.09)、3.60 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组(0.883±0.08)A值明显升高(P<0.05)，而黑苏嘎-25浓度为0.03 mg/ml时细胞A值(0.544±0.004)变化无统计学意义(P>0.05)。黑苏嘎-25浓度为1.8 mg/ml与3.60 mg/ml时细胞A值变化无统计学意义(P>0.05)。

2.4不同浓度黑苏嘎-25对缺氧处理的NSCs细胞凋亡的影响 与NC组〔(6.81±0.62)%〕比较，12 h缺氧组〔(23.57±2.11)%〕凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与12 h缺氧组比较，0.10 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组〔(19.63±1.86)%〕、0.30 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组〔(13.52±1.24)%〕、0.90 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组〔(9.63±0.91)%〕、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组凋亡率〔(7.98±0.73)%〕降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图2。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.5不同浓度黑苏嘎-25对缺氧处理的NSCs细胞CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况 与NC组比较，12 h缺氧组CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与12 h缺氧组比较，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组CyclinD1、Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

1～6:NC组，12 h缺氧组，0.10 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组，0.30 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组，0.90 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组，1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组；图4同图3 Western印迹检测CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.6黑苏嘎-25对缺氧处理的NSCs细胞炎症因子水平的影响 与NC组比较，12 h缺氧组IL-6、TNF-α的水平明显升高(P<0.05)；与12 h缺氧组比较，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组IL-6、TNF-α的水平明显降低(P<0.05)，见表2。

2.7黑苏嘎-25对缺氧处理条件下Cx43蛋白表达的影响 与NC组比较，12 h缺氧组Cx43蛋白水平明显升高(P<0.05)；与12 h缺氧组比较，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑苏嘎-25+12 h缺氧组Cx43蛋白水平明显降低(P<0.05)，见表2、图4。

图4 Western印迹检测Cx43蛋白的表达

3 讨 论

植物提取物可通过促进神经干细胞的增殖和神经元分化而减轻神经细胞损伤，还可促进髓鞘再生改善缺氧缺血性脑损伤〔9～11〕。黑苏嘎-25主治偏瘫、半身不遂等，具有抗脑缺血作用，还具有副作用小、作用多途径、多靶点等特点，可减轻脑缺血再灌注损伤，其作用机制可能与降低炎症因子的水平有关〔12〕。本研究结果显示，缺氧处理后可明显降低神经干细胞活力，并可降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平及提高Bax蛋白水平，与相关文献报道结果相似〔13，14〕。提示成功建立神经干细胞损伤模型。本研究结果提示，黑苏嘎-25可促进缺氧诱导的神经干细胞增殖，可抑制缺氧诱导的神经干细胞凋亡。本研究进一步证实黑苏嘎-25可明显提高缺氧诱导的神经干细胞中CyclinD1、Bcl-2的表达水平，还可降低Bax的表达水平，证实黑苏嘎-25可促进缺氧诱导的神经干细胞增殖及抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤。IL-6、TNF-α水平升高可加重神经干细胞损伤〔15〕。本研究结果提示，黑苏嘎-25可抑制缺氧诱导的神经干细胞炎症反应从而减轻细胞损伤。

Cx43在LPS诱导的多巴胺神经元退变中可发挥重要调控作用，并可能作为帕金森病的治疗靶点〔16〕。抑制Cx43可通过Janus酪氨酸激酶(JAK)2/信号传导和转录激活因子(STAT)3途径减轻脑缺血/再灌注损伤〔17〕。Cx43在心肌缺血/再灌注损伤中可发挥重要调控作用〔18〕。本研究结果提示黑苏嘎-25可能通过下调Cx43表达从而减轻缺氧诱导的神经干细胞损伤。

综上，黑苏嘎-25可能通过下调Cx43表达而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎症反应从而减轻缺氧诱导的神经干细胞损伤，Cx43可能作为黑苏嘎-25治疗缺血性脑卒中的作用靶点，但关于其作用机制仍需进一步探究。