Diversin对胃腺癌细胞恶性转化、侵袭和迁移能力的调控作用

李楠洋 吴非 韩斌 王翠芳 栾岚

(沈阳医学院 1附属中心医院病理科，辽宁 沈阳 110024；2基础医学院病理学教研室；3中国医科大学附属盛京医院泌尿外科)

胃癌是当今发病率较高的消化系统恶性肿瘤。本课题组长期致力于锚蛋白重复序列6(Diversin)在肿瘤的发生发展侵袭转移机制的相关研究，前期结果显示Diversin在非小细胞肺癌〔1〕、三阴乳腺癌〔2〕、神经胶质瘤〔3〕中高表达。免疫组化结果显示，Diversin在胃腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,Diversin的表达主要定位于肿瘤细胞的胞质与胞膜处〔4〕，且Diversin与胃癌患者的肿瘤直径、TNM分期、有无淋巴结转移相关〔5〕。本课题组利用基因芯片技术分析下调肿瘤细胞中Diversin与对照组中信号通路及下游靶分子的变化。基因芯片结果显示，Diversin可显著激活肿瘤细胞的G1/S期检测点，这一结果提示Diversin很可能在胃癌细胞的细胞周期调控机制中发挥重要作用。同时基因芯片结果显示Diversin可以显著激活Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK-5信号通路，而研究表明ERK5可以显著上调肝癌〔6，7〕、卵巢癌〔8，9〕、前列腺癌〔10，11〕及肺癌〔12〕的淋巴结黏附功能〔13，14〕，Wnt/JNK信号通路的激活广泛存在于非小细胞肺癌〔14〕、口腔鳞癌〔15〕、三阴乳腺癌〔16〕及食管癌〔17〕中，并且对肿瘤的发生发展和预后发挥重要的调控作用。综上，Diversin很可能是调控胃癌淋巴结黏附甚至是调控淋巴道转移的关键分子之一。本实验旨在探讨Diversin对胃腺癌细胞恶性转化与侵袭转移的调控作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 胃未分化癌细胞系HGC27和胃中分化癌细胞系MNK45购买于长沙优生物有限公司，RPMI1640培养基和胎牛血清购买于BI公司。 Diversin过表达载体GV326质粒(Div-GV326)与Diversin shRNA载体GV248质粒(Div sh-GV248)由上海吉玛公司合成。Transwell小室购买于millipore公司。结晶紫染液购买于碧云天生物技术有限公司。Diversin抗体购买于Santa Cruz公司，β-actin抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔购买于碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养 人胃腺癌细胞HGC27和MNK45细胞系培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液内，同时将细胞置于浓度为5%CO2的细胞培养箱内培养。细胞复苏：从液氮中取出HGC27和MNK45细胞，迅速置于37℃水浴中，使其在1 min内完全融化，将细胞悬液加入15 ml离心管中并加入高压灭菌过的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，1 000 r/min，5 min离心后弃上清，加入含10%FBS的RPMI1640培养液，轻柔吹打混匀，细胞悬液移至培养瓶中，充分混匀后，将培养瓶转移至细胞培养箱中培养，培养条件为37℃，5%CO2，培养12 h后待细胞贴壁生长后，弃去培养瓶中的培养基，加入高压灭菌的PBS洗涤细胞，加入含10%FBS的RPMI1640培养基，将培养瓶置于恒温培养箱中培养。细胞传代：待细胞接合度达到80%～90%时，吸去旧培养液，培养瓶加入高压灭菌过的PBS洗涤细胞，加入胰酶消化细胞1～2 min后加入含10%FBS的RPMI1640培养液终止消化，吹打混匀细胞后，将细胞分装于新的细胞培养瓶中，每瓶加入5 ml含10%FBS的RPMI1640培养基，置于恒温培养箱中培养细胞，培养条件为37℃，5%CO2。

1.3质粒转染 将处于对数生长期的HGC27细胞和MNK45细胞用胰酶消化，用加入含有10% FBS的RPMI1640培养基终止消化，然后轻柔吹打细胞成单细胞悬液。将细胞悬液均匀接种于6孔板中，每孔约10 000个细胞，随后将6孔板置于37℃，5%CO2培养箱中孵育，待细胞接合度达到70%时进行转染。为了上调Diversin的表达水平，分别利用转染Diversin过表达质粒Diversin-GV326到HGC27和MNK45细胞分别作为HGC27上调组和MNK45上调组，同时转染GV326质粒到HGC27和MNK45细胞中分别作为HGC27上调对照组和MNK45上调对照组。为了下调Diversin的表达水平，分别利用转染Diversin sh-GV248质粒到HGC27和MNK45细胞分别作为HGC27下调组和MNK45下调组，同时转染GV326质粒到HGC27和MNK45细胞中分别作为HGC27下调对照组和MNK45下调对照组，转染Diversin-GV326和Diversin sh-GV248质粒的工作浓度分别为250 ng/ml和50 ng/ml。采用携带新霉素(G418)抗性标签的GV326过表达质粒和携带嘌呤霉素的GV248质粒进行转染。筛选合适的G418和嘌呤霉素浓度用以维持稳定的阳性转染细胞。利用转染GV326质粒构建Diversin过表达载体和GV248质粒构建Diversin shRNA的RNA干扰质粒分别上调和下调HGC27和MNK45细胞中Diversin的表达水平，并且用含G418浓度为20 μg/ml和40 μg/ml的RPMI1640培养基分别培养HGC27细胞和MNK45细胞，含嘌呤霉素浓度为2 μg/ml和3 μg/ml的RPMI1640培养基分别培养HGC27细胞和MNK45细胞。

1.4蛋白印迹 将转染72 h的细胞从培养箱中取出，弃去培养基，高压灭菌的PBS洗涤细胞，加入胰酶消化细胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，将细胞轻柔吹打成细胞悬液；加入细胞裂解液〔0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH7.5,20 μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.1%免疫染色通透液(Triton X)-100〕500 μl吹打细胞，冰上静置4 h，12 000 r/min，低温离心20 min，取上清进行蛋白定量。

配制浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和12%的聚丙烯酰胺凝胶，每孔加入100 μg用溴酚蓝缓冲液稀释的样品，浓缩胶阶段采用70 V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂达到分离胶后将电压调至100 V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂达到局凝胶下缘0.5 cm时，终止电泳；将凝胶取出，将凝胶中的样品转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脱脂奶粉/TTBS 于室温封闭2 h,TTBS洗涤3次每次5 min;利用TTBS稀释一抗Diversin抗体〔Santa Cruz兔抗人 免疫球蛋白(Ig)G〕和β-actin(碧云天 小鼠抗人)稀释倍数分别为1∶200和1∶1 000，4℃孵育过夜,TTBS 洗3次每次15 min，二抗(小鼠 IgG Biotin,1∶2 000) 37℃1 h,TTBS 洗涤3次，每次15 min;将 PVDF 膜放入凝胶成像自动检测仪的暗室中。滴加电化学发光(ECL)工作液到膜上，进行检测，使用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白和内参β-actin 的光密度比值，作为目标蛋白的表达相对量。

1.5克隆形成实验 将转染72 h的细胞从培养箱中取出，弃去培养基，高压灭菌的PBS洗涤细胞，加入胰酶消化细胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，将细胞轻柔吹打成细胞悬液；将各组细胞分别接种于6孔板内，每孔接种细胞数为5 000个，加入1 ml含10%FBS的RPMI1640培养基后将6孔板置于37℃恒温培养基中培养，每24 h更换一次含10%FBS的RPMI1640培养基，HGC27细胞和MNK45细胞系分别培养48 h和72 h后进行观察；将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，PBS洗涤3次。将6孔板倒扣在干净的吸水纸上空干残留液体。加入37%甲醛溶液，室温固定10 min，吸去甲醛溶液并空干残留液体，加入结晶紫染液0.5 ml室温染色10 min。染色后吸去结晶紫染液，PBS洗涤3次，每次10 min，将6孔板倒扣于干净的吸水纸上空干残留液体，将6孔板置于灯箱上观察，计数各组染色阳性的单克隆个数比较各组差异，上述实验重复3次。

1.6Transwell 将转染72 h的细胞从培养箱中取出，弃去培养基，高压灭菌的PBS洗涤细胞，加入胰酶消化细胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，将细胞轻柔吹打成细胞悬液。将Transwell小室(含matrigal)置于24孔板上，用RPMI1640培养基将各组细胞吹打成单细胞悬液，接种于上室，每个小室接种细胞数为500个；下室加入500 μl 含10%FBS的RPMI1640培养基，将各组细胞所在的24孔板至于37℃ 5%CO2培养箱中分别孵育HGC27细胞和MNK45细胞12 h和24 h。孵育结束之后将小室取出，用一次性医用棉签拭去上室中的细胞，然后将小室置于干净的吸水纸上空吸去残余液体后置于37%甲醛溶液中固定5 min，然后立即将小室取出置于结晶紫染液中染色10 min，染色完毕后将小室置于PBS中漂洗洗去多余的结晶紫溶液，将小室置于新的24孔板中，在放大倍数为20倍的光镜下，随机选取5个视野，通过计数成功到达小室下室的细胞数的不同反映各组细胞侵袭能力的不同，结果取平均值，实验重复3次。

1.7划痕试验 将转染72 h的细胞从培养箱中取出，弃去培养基，高压灭菌的PBS洗涤细胞，加入胰酶消化细胞1～2 min后用含10%FBS的RPMI1640培养基终止消化，将细胞轻柔吹打成细胞悬液。将单细胞悬液接种于6孔板中每孔不少于2×106个细胞，37℃ 5%CO2培养箱中培养。待细胞重合度达到95%以上后用记号笔在6孔板底部划线标记，然后用20 μl Tip头在垂直于记号笔标记方向将6孔板中细胞划痕，然后显微镜下拍照记作0 h，将HGC27和MNK45各组细胞所在的6孔板置于37℃ 5%CO2培养箱中，于6 h后取出MNK45上调组与上调对照组，12 h后取MNK45下调组与下调对照组，8 h后取出各组HGC27细胞。在放大倍数为20倍的镜下，观察各组细胞向划痕中迁移的趋势，并且记录划痕两侧细胞的距离，上述实验重复3次。

1.8统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1上调和下调HGC27和MNK45细胞中Diversin表达水平 HGC27上调组和MNK45上调组中Diversin表达水平分别显著高于HGC27上调对照组和MNK45上调对照组(P<0.05)，而HGC27下调组和MNK45下调组中Diversin的表达水平分别显著低于HGC27下调对照组和MNK45下调对照组(P<0.05),上述处理方式可较长时间维持相应细胞中Diversin的表达水平。见图1和表1。

2.2Diversin促进胃癌细胞恶性转化 HGC27上调组和MNK45上调组形成的克隆数分别显著高于HGC27上调对照组和MNK45上调对照组(P<0.05)，而HGC27下调组和MNK45下调组形成的克隆数分别显著低于HGC27下调对照组和MNK45下调对照组(P<0.05)。见图2和表1。

2.3Diversin上调胃癌细胞侵袭能力 HGC27上调组和MNK45上调组成功到达Transwell小室下室的细胞数分别高于HGC27上调对照组和MNK45上调对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而HGC27下调对照组和MNK45下调对照组成功到达Transwell小室下室的细胞数分别低于HGC27下调组和MNK45下调组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3和表1。

2.4Diversin上调胃癌细胞的迁移能力 HGC27上调组和MNK45上调组划痕区域中的细胞数分别显著高于HGC27上调对照组和MNK45上调对照组(P<0.05)，而HGC27下调组和MNK45下调组划痕区域中的细胞数分别显著低于HGC27下调对照组和MNK45下调对照组(P<0.05)。见图4和表1。

表1 各组Diversin表达蛋白印迹、克隆形成试验、Transwell和划痕试验结果

3 讨 论

克隆形成实验显示Diversin可能是促进胃癌细胞恶性转化的因素，为了证实Diversin参与调控胃癌细胞恶性转化的作用，本课题组前期实验中，基因芯片结果显示Diversin的表达水平可能与肿瘤细胞中Wnt/JNK信号通路和ERK信号通路的活性相关，研究表明在胃的恶性溃疡组织中，溃疡灶中Wnt/JNK信号通路靶分子的表达水平显著高于正常胃黏膜组织〔18，19〕，其中过表达核转录因子(NF)-κB的胃未分化癌HGC27细胞中Wnt/JNK信号通路的活性显著升高〔20〕，而经典Wnt/β-catenin信号通路下游靶分子的表达水平并未显著升高〔21〕，以上研究结果提示，在恶性程度较高的胃癌细胞中Wnt/JNK信号通路可能发挥重要的调控细胞恶性转化的作用。

本研究中Transwell和划痕试验结果提示Diversin可能参与调控胃癌细胞的侵袭转移能力。肿瘤侵袭转移的初始过程包括黏附和浸润两个过程。为了证实Diversin对胃癌细胞恶性转化的调控作用，本课题组后续实验计划利用Diversin稳定上调和稳定下调的胃癌细胞系开展体外淋巴结黏附试验，并从mRNA和蛋白水平分析黏附相关分子黏着斑激酶(FAK)，基质金属蛋白酶(MMPs)，CD22等基因的表达情况，并且利用明胶酶谱分析Diversin对胃癌细胞中MMP活性的调控作用对上述结果进行完善。为了更直观地检测Diversin调控胃癌细胞恶性转化与侵袭转移的作用及其机制，本课题组后续将对Diversin稳定上调和稳定下调的胃癌细胞开展裸鼠荷瘤实验，进一步明确Diversin对胃癌细胞侵袭转移和恶性转化过程的调控作用。同时有研究表明肿瘤的发生发展与免疫细胞的功能异常有着密切关系，巨噬细胞的M2型极化与胃癌、结肠癌的发生发展、血管新生、免疫逃逸等生命活动密切相关〔21，22〕，本课题组后续实验拟将Diversin稳定上调和稳定下调的胃癌细胞与巨噬细胞或淋巴细胞进行三维共培养并开展动物实验，完善Diversin调控胃癌细胞发生发展过程中信号网络的研究。