水和食品中卫生细菌的快速检验研究进展

王婷

（北流市疾病预防控制中心，广西 北流，537400）

当下，由于饮用水及食品中的致病菌污染引发的传染病及食物中毒等不良事件时常发生。因此需对水果、蔬菜、肉类等食物定期实施细菌的检测，以对细菌污染的状况进行了解。若仅采用单纯的常规检验方式，则检验周期较长，无法在较短的时间内快速得出鉴定结果。因此，多种快速检验方式应运而生。只有采用快速检验方式对大量的食物样品及饮用水实施检验，及时发现问题并实施干预措施才能有效避免各种肠道传染病及食物中毒等不良事件的发生。本文对饮用水及食物中卫生细菌的快速检验进展综述如下。

1 分子生物学检验方式

聚合酶链反应是近年来应用于检验及研究不同致病微生物的新型技术。目前对于该种检验方式的研究也在不断的深入，如派生出定量、多重及免疫PCR 等。但PCR 技术检验细菌的原理是采用细菌中各菌种的核酸序列，从而设计出相关引物，对细菌核酸实施扩增，使用核酸检测仪及凝胶电泳对扩增结果进行观察。

1.1 多重PCR丁卫平[1]等对食品中的单核细胞增生性李斯特氏菌的hlyA 及iap 实施多重PCR，分别扩增出131-bp 及234-bp片段。汪斌[2]等利用大肠杆菌所特有的eaeA 基因设计的多重引物，同时扩增出DNA 及1087bp 序列。多重PCR 检验方式具有较高的准确度、特异度及灵敏度，且能快速得出检验结果。

1.2 免疫-PCR杨艳[3]等先采用免疫磁性颗粒对肉类中沙门氏菌实施分离，后再对其应用PCR 予以检验。所使用的的免疫磁性颗粒上包被羊抗鼠lgG 的抗体并再与单克隆抗体相连。实验过程中，取1ml 经过培养的增菌液，后加入免疫磁性颗粒5ul，并持续摇晃10min，后在磁场的作用下使磁颗粒逐渐向磁极积聚，去除上清液。采用无菌生理盐水对磁颗粒实施清洗。磁颗粒重悬于20ul 水中，加热至90℃，5min 以使细菌裂解，使用离心法将磁颗粒进行去除，将上清液用于PCR 检验。研究结果显示，使用缓冲蛋白胨水增菌培养24h 最低检验限为1g 肌肉染有0.1CFU 的沙门氏菌。

1.3 随机扩增多态性一般微生物遗传物质均有较高的特异度，但时常种属相似的微生物间有同源序列，使按照某一种细菌DNA 片段设计出的引物，时常对其他细菌也可扩增出一样的产物，使检验结果出现假阳性的现象。此时应用随机引物可将两种致病菌经采用PCR 扩增出不同的DNA 图谱，按照不同图谱的特征对致病菌进行区分。相关研究学者曾使用不同致病菌，经PCR 检验大肠杆菌O157：H7eaeA 基因的引物的特异性，发现猪霍乱沙门氏菌也可扩增出一样的产物[4]。由经采用1 条S571随机引物对两个致病菌实施PCR 检验，对扩增产物进行凝胶电泳，两种致病菌DNA 图谱存在明显不同，进而可准确的将其区分。

1.4 采用PCR 研究致病菌致病机理陈建林[5]等采用PCR 检验对副溶血性弧菌的耐热直接溶血素及耐热、直接溶血素的因素实施检验，其认为判定弧菌致病机理的依据为耐热溶血素。副溶血性弧菌存在耐热溶血素即可致病，神奈川阴性仅在体外条件下未充分表达[6]。应用生物学技术对细菌进行鉴定不仅有较高的准确性，其能对细菌的致病机理从分子水平上实施进一步研究。

2 免疫学检验方式

免疫学检验检验仪器相对价廉，操作过程简便，实用性较好，在卫生检验方面的应用得到认可。

2.1 酶联免疫吸附法潘子强[7]等分别应用单克隆及多克隆抗体的酶联免疫吸附法检验大肠杆菌 O157：H7，其不仅能应用于临床检验，同时能应用于水及食物细菌检验中。酶联免疫吸附法操作简单、快速，且具有较高的准确性及特异性，是对大量样品实施诊断的理想检验方式。

2.2 免疫胶体金技术免疫胶体金技术是一种新型的免疫学检验技术，霍乱主要经粪-口途径传播。李倩茹[8]等以胶体金技术作为基础，设计出一种检验霍乱弧菌的试剂盒。在检验过程中，先使细菌与单克隆抗体结合，再使其与多克隆抗体结合，使得大量的致病菌被捕获，因细菌与有鲜红的胶金颗粒结合，进而可通过肉眼直接观察检验结果。彭志兰[9]等采用相似的膜条层析免疫法对霍乱弧菌实施检验，在较短的时间内即可判断检验结果。

2.3 免疫磁性分离技术张蕾[10]等将沙门氏菌的免疫磁球与其他培养基进行结合应用，对生禽中的沙门氏菌实施分离，免疫磁性分离技术可显著提升致病菌的检出率。苏涛[11]等该种检验技术与比色法测定PCR 产物相结合，对饮用水及食物样品中的耶尔森氏菌实施分离及检验。多种检验技术的联合应用，可实现检验的完全自动化，可显著减少检验人员的工作量，适合在大量样品检验中应用。

3 生物传感器技术

生物传感器技术使用生物体本身作为敏感材料，通过合适的方式固定于分子识别元件，在于信号转换器件组成的传感器[12]。该种技术在微生物代谢及细菌计数的生物电极检验中的应用得到认可。井良义[13]等采用氧传感器对细菌数进行快速检验，使其达到实用程度。凡是含有过氧化氢的细菌均可出现该种反应，该种检验方式最低检验限为104个/ml 细菌。实际检验过程中无需实施培养，将被检样品制成检液后即可完成检验，适用于单一致病菌的快速计数。

4 显微染色计数法

显微染色计数法是将细胞进行染色，借助显微镜计算细胞的数量的方式。

4.1 丫啶橙染色计数法相关研究学者曾采用丫啶橙染色法对细菌实施镜检，操作步骤为：取水样本10ml 加入试管中，加入甲醛样品0.5ml，最后加入丫啶橙溶液2ml，染色3min，后将细菌过滤至滤膜上，将1 滴香柏油滴入，将盖玻片盖上，置于显微镜下计数菌数[14]。通过对视野及滤膜面积进行测量计算出样本中所含的细菌数量。该种检验方式可因细菌在滤膜表面分布不均匀造成样品体积较小的细菌数量出现偏差。

4.2 活菌直接计数法活菌直接计数法的原理是利用吡哌酸及吡咯酸对细菌DNA 的复制产生抑制，造成其无法分裂，但不会对细胞内其他合成途径的转运造成影响，在一定浓度营养物质存在的情况下，菌体生长，变大，通过荧光染色，易计数出来[15]。采用DVC 技术的发现细胞还存在新的存活方式：活的非可培养状态。在液体中无法繁殖成一定大小的菌落，并不说明其已经死亡，有可能是变成活的非可培养状态，仅是在培养环境下无法进行繁殖[16]。一旦培养条件适宜，病原菌复苏后仍具有较强的致病能力。

5 微菌落计数法

近年来有诸多研究学者对微菌落计数进行进一步研究及应用。因其可通过短时培养，借助显微镜即可观察检验结果，具有较高的准确性，通过将其完善，可用于基层对水及食物中的细菌实施快速检验[17-18]。邹翔[19]等采用聚碳酸酯滤膜对水样品实施过滤，并在营养琼脂平板上培养3h，将滤膜上的菌落实施加热及固定，并使用复红染色实施漂洗，借助显微镜对菌落进行观察。该种检验方式重复性好，且与琼脂倾注平板法相比，检测大肠菌群，检验结果无明显差异。

不同的快速检验方式均具有不同的优势及缺陷。整体来看，快速检验方式在卫生检验方面的应用得到认可，有望成为对水及食物中细菌快速检验的方式，微菌落及显微染色计数法最可能实现，其能快速的检验出被检样品中卫生状况。