食源性病原微生物快速检验技术的应用与研究进展

吴青梅

（扶绥县疾病预防控制中心，广西 崇左，532199）

食源性病原微生物的检测，先进行前增菌，再用选择性培养基进行分离培养，并通过体外人工进化程序筛选，可明显提升检测的灵敏性及准确性，这也是目前食源性病原微生物快速检测技术发展面临的挑战，目前从自然界微生物中筛选某菌种一般需8～48 h，占用较长的时间，采用提高灵敏度的措施，在细菌检测中只需短时间增菌，达到检测的目的，这是快检方法发展的一个必然趋势；另外，常规方法对实验室常规检测中不同目标微生物增菌，增加工作量和工作难度，检测效率还不高，快检技术需要解决对实验数据有一定的干扰非优势菌的检验问题[1]。近年来，灵敏度高且快速的食源性致病菌检测方法不断完善，它需要利用生物化学、微生物学、细胞生物学进行检测，将朝着高灵敏度、多标记、多残留、高通量方向发展[2]。

1 食源性病原微生物快速检验技术

1.1 食源性病原微生物快速检验免疫胶体金技术免疫胶体金技术以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的免疫学检测技术，它是20 世纪60 年代发展起来的一种新型体外快诊断方式[3]。胶体金技术具有特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点，在临床诊断，环境污染，食品安全检测中得到了日益广泛的应用，当前这项技术较少应用于微生物检测中，往往需要计算检测的灵敏度、特异性问题，一般灵敏度达到1×106CFU/mL，5 min 内显示结果，但是，对于致病性微生物的监测有沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌等是不允许检出的，此方法不能取得实际成效及推广应用价值[4]。

目前，有研究将免疫测定技术与PCR 结合建立免疫-PCR 免疫胶体金技术，可获得较高的检测灵敏度和特异性。刘志科，杨宁宁，徐明国，等[5]研究中PCR 鉴定用鸡白痢沙门氏菌特异性引物进行PCR 检测，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定，最终得到了invA 融合蛋白，作为进行抗原抗体反应的免疫检测手段，这种标记物的制备方法显著提升现有分析方法的灵敏度及特异性，降低假阳性率；并在此基础上使生物胶体金银染技术迅速发展起来，设计与目标微生物沙门菌invA 基因，在经醛基化处理的玻片上点加探针，并与提取的靶DNA 或靶探针连接成一条序列与探针特异性序列完全互补，待测核酸杂交靶探针结合巯基化探针生成复合结构，利用胶体金能稳定而又迅速吸附蛋白法而不改变生物活性的特点通过在胶体金上连接巯基化DNA 或蛋白质，银染放大信号，对目标微生物直接取样进行分析，特异性强、灵敏度高，该技术可作为DNA 芯片技术的微生物检测方法，可以实现生物样本的高通量并行检测[6]。

1.2 食源性病原微生物快速检验免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)是一种生物亲和技术，将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合进行分离富集，用于细胞分离和提纯使用，它分离速度快、过程简单、成本低，完善了传统的致病性微生物检测不足，经免疫磁珠分离富集后，使吸附平衡的时间大大缩短，在微生物快检技术应用中可行性较高，是构成微生物快检技术开放很重要的一环[7]。免疫磁珠技术结合其他检测技术应用于食源性病原微生物的检测，具有很大的应用价值，未来其发展空间也很广泛。

在研发这项技术方面需要着重探究。纳米磁珠质量是影响检测结果的因素，不易制备，这项技术的重点在于研发优质的纳米磁珠。在抗体制备上，将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上将针对特定病原微生物的多抗或单抗偶联到磁珠微球体上，把修饰后的磁珠和待检样品的增菌液混合，通过抗原抗体反应，将目标病原体分离出来[8]。因此，这项技术要应用到食源性病原微生物免疫检测中很重要的一点就是找到致病菌的特异性抗原靶标。

但因食品基质微生物菌群多样又复杂，容易影响抗体，选取的抗原靶标不特异，将掺入较多杂菌，杂菌抑制了目标菌的生长繁殖，也导致无法正确检测到目标菌，目前适用于不同来源的病原微生物检测技术产品通用性较差，对复杂食品样品微生物的检测，灵敏度并不高，不容易稳定，因此，找到合适的特异性较高的抗原靶标，未来这项技术将朝向用多种单克隆抗体技术和其他技术相联合的方向发展[9]。

1.3 食源性病原微生物快速检验飞行时间质谱技术基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorpt ion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS)对细菌检测，其原理是每种微生物都有其自身独特的蛋白质组成，细菌蛋白质与基质结合后，利用激光电离将蛋白提取出来，入检测器后，便被捕获，结合各分子量的蛋白质经过飞行管耗时从而对样品进行定性和定量分析[10]。样品预处理过程应简单易行，菌落直接涂于靶板上，也可以使用甲酸萃取法将蛋白后上靶板给提取出来，获得高质量的分辨率、穿透率高的质谱图，省去了对样品预先评估环节，操作简便快速，使用成本低，结果准确，分辨率更高。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)目前在各个领域应用广泛，该方法相较传统的生化反应鉴定操作相对烦琐、费时，其高灵敏度、自动化的操作，试验成本较低[11]。

我国常见食源性致病菌的检测方法成为研究的热点，构建了对应的检测体系，为微生物的快速检测提供了检测技术。而微生物蛋白质具有庞大的信息量，细菌蛋白质表达具有不确定性，不易进行微生物的溯源分型，过程中需要对数据进行各种处理和归类，满足准确分型的应用，目前部分学者对微生物分型追踪溯源进行研究，往往是完善数据，进行基础的研究。另外，研究着重从微生物的培养基、菌体前处理等采用MALDI-TO检测[12]。

MS 技术检测方法研究，获得了具有普遍适用性，易于推广检测的优化条件；将样本菌涂在测试靶板上，进行研究，投入成本低，操作方便，获得可替代的一次性纸靶板，省去繁杂的操作步骤，还能节省检测洗靶的时间；在不采取前处理措施情况下，对血流感染的细菌快速鉴定[13]。另外，这些技术同时联合其他技术，有效拓宽了检测适用范围。

基于细菌表面蛋白分子量检测的MALDI-TOF-MS 技术现阶段尚且未形成对应的检测标准，但由于其高准确性、快速周转时间和低成本等优点，使得该技术在全球微生物实验室被广泛采用。而部分菌属的蛋白质水平不显著，不利鉴定结果的准确性，若对单增李斯特氏菌和蜡样芽胞杆进行检测，不易获得准确检验结果，需要采用二级质谱鉴定方法进行蛋白质的细分，当然需要更加优良的分析系统和软件支撑。另外，对于各种常见食源性致病菌鉴定和分型方面，仍需要对数据库和实验室数据库都进一步扩展和完善。

2 总结与展望

微生物快速检测方法无法检测病毒等方面，其局限性日益显现，需要增菌培养、检验全过程必须严格遵守无菌操作，因此，不如真菌毒素、违禁食品添加剂等化学性有害物的快速检测方法应用范围广。但近年来，多学科交叉的应用、食品检验体量越来越大，使食源性病原微生物快速检测技术获得了很大的进展。通过对生产技术在原有基础上的局部改进和创新，使检验效率和检验结果的准确性得到了极大提高，并对解决部分专业局限的可行方案进行了优化，使快速检测技术发展十分迅速，比如应用分子生物学方法不断完善，这些技术还存在着薄弱环节，需逐步研究改进和拓展，而将引领食源性病原微生物的快速检测工作的前行。