慢性HBV感染者血清持续低水平HBsAg表达免疫耐受机制的研究进展

吴 婕，张英杰，周华君，成 军（.蚌埠医学院检验医学院，安徽蚌埠 33000；.中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院，杭州 3003）

在全球范围内，慢性乙型肝炎感染者约有2.57亿人[1]，每年死于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染及其相关性疾病的约有88.7 万人，我国属于HBV 中高度流行区。乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）作为HBV感染者血清中率先出现的病毒蛋白标志物，国内外专家一致认为：当患者血清HBsAg 完全清除或出现血清学转换即为慢性HBV感染理想的治疗终点[2]。慢性HBV感染者中存在着一部分血清持续低水平HBsAg表达人群（经1年以上随访，血清HBsAg 检测3 次以上，每次采样间隔3 个月以上且检测结果均在10.0 IU/ml 以下，呈持续低水平表达的一类慢性HBV感染者），其可能与病毒的清除、变异及隐匿性HBV感染密切相关。血清低水平的HBsAg 常反映出宿主对HBV 复制及细胞再感染具有较好的免疫抑制能力[3]，然而持续低水平的HBsAg 可能无法刺激机体产生免疫应答或低应答，长期的无应答或低应答状态可能导致宿主针对持续低水平HBsAg表达形成免疫耐受，从而无法实现完全清除HBV。现就近年来国内外血清持续低水平HBsAg表达的慢性HBV感染者其免疫耐受机制的研究进展进行综述。

1 低水平HBsAg与免疫耐受

1.1 低水平HBsAg定义 有报道[4]使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）定义定量检测血清HBsAg ＜50.0 IU/ml 为低水平HBsAg，但有研究显示ELISA 检测低水平HBsAg存在漏检情况[5]。由于检测方法、高灵敏度试剂盒的陆续开发，关于低水平HBsAg的定义不断更新，然而根据研究内容的差异，实验室对高水平HBsAg和低水平HBsAg 也有不同的分组标准。如刘立等[6]对低水平HBsAg 患者的肝脏组织病理变化的研究中，选用HBsAg 在0.05～1 400 IU/ml 为低水平组。熊洪海等[7]对干扰素联合核苷类药物治疗HBV的研究中，定义HBsAg 定量低于4 000 ng/ml 为低水平组。JIN 等[8]在评估HBsAg/抗-HBs 共存的血清学模式与慢性HBV感染者肝细胞癌发生风险之间的关系中，将血清HBsAg水平＜1 000 IU/ml的样本视为低水平组。而本实验室采用化学发光微粒子免疫分析法代替传统的ELISA 定量检测血清HBsAg，一般认为血清HBsAg 含量＜5.0 ng/ml 或＜10.0 IU/ml 为低水平HBsAg[9]，相较以往研究对低水平HBsAg 阳性的检出率明显提高，而低水平HBsAg 检出是否存在假阳性，必要时可对其进行确认试验，以保证实验结果的准确度。

1.2 持续低水平HBsAg表达免疫耐受 血清持续低水平HBsAg表达的形成机制可能与多种因素有关，如基因突变致使病毒逃避免疫监视（S 基因突变[10],Pre-S 基因突变[11],C 基因突变[12]），表观遗传学的改变导致HBsAg表达减少（HBV DNA 高度甲基化[13],microRNA 反馈机制[14],组蛋白低乙酰化[15]），宿主免疫系统功能紊乱形成免疫耐受（免疫因子IL-6,IL-10 等）[16-17]及循环免疫复合物（circulating immune complex,CIC）形成[18]等。血清持续低水平HBsAg表达为病毒与宿主清除在多种因素作用下，达到一种相对稳定而复杂的动态平衡状态[19]，其中HBV 免疫耐受研究被认为是持续低水平HBsAg 形成的关键因素，已成为持续低水平HBsAg表达形成机制研究的热点和HBV 治疗突破口。截至目前，临床上针对HBV 治疗不断尝试多种途径来打破免疫耐受，从而激活免疫应答：如联合核苷类药物和干扰素提高HBsAg 转阴率[7]，调控细胞因子（IFN-γ,IL-4 等）浓度进行非特异性免疫调节治疗[20]，运用抗HBV 治疗性疫苗进行特异性免疫治疗[21]等，但效果却差强人意。因此，深入研究持续低水平HBsAg表达免疫耐受的形成机制，将为HBV 临床治疗提供新思路。

2 持续低水平HBsAg表达免疫耐受形成机制

2.1 病毒自身适应性变异与免疫逃逸 HBV 属嗜肝DNA 病毒科，由于病毒基因组特殊的共价闭合环状DNA 结构，致使现有的治疗策略仍无法彻底根除HBV[22]，只要有少量DNA 残留即可作为模板进行病毒复制，极易引起HBV 复发。慢性HBV感染者体内存在大量的HBV 颗粒和病毒蛋白，病毒蛋白和免疫系统之间能发生多种相互作用，有研究表明[23]，HBV 通过RNA 中间体完成复制，其过程易出错，导致迅速产生密切相关但不完全相同的病毒变异株，包括可以逃脱宿主免疫应答和抗病毒治疗的病毒变异株。HBsAg 由单个开放阅读框(open reading frame,ORF)编码，该阅读框被Pre-S1,Pre-S2和S 区域中的三个框内起始密码子分开[24]，张凯等[25]研究发现Pre-S2 缺失突变使病毒缺失免疫反应相关表位，影响T 细胞对抗原的识别，病毒逃避宿主免疫监视，使其在体内呈现低水平复制；另外，HBV 变异株的基因组中易发生大量缺失突变可以进一步增加慢性HBV感染的复杂性，并且HBV 有完整的蛋白质外壳及很强的自我保护能力，一般药物难以清除，而且HBV 由于免疫逃逸产生变异，当药物持续作用于特定部位，导致该部位碱基发生改变，极易产生耐药性，进而使原有针对HBV 治疗的敏感药物失效。KIRDAR 等[26]研究发现，部分接受核苷/核苷酸类似物治疗的慢性HBV感染者，HBV pol/S 基因产生耐药性突变，这种HBV自身适应性变异可能使病毒发生免疫逃逸，形成免疫耐受。

2.2 病毒感染靶细胞 HBV 主要在肝细胞内完成复制，如果要彻底抑制HBV 复制，药物需进入肝细胞内才能发挥作用。肝脏诱导免疫耐受的功能具有独特性[27]，呈现持续性表达的抗原常会诱导肝脏针对该抗原产生局部或全身性的免疫耐受而非免疫应答。肝脏的生理结构、细胞组成等特性为肝脏诱导免疫耐受提供时间、空间基础，从而通过诱导T 细胞克隆清除、克隆无能、免疫偏离及诱导免疫负调控细胞等多种机制实现系统性免疫耐受[28-29]，同时HBV 利用肝脏的免疫耐受环境，可能导致病毒持续感染和癌症快速发展[30]。也有研究结果表明适应性免疫细胞在肝脏中比其他器官更易耐受[31]，且适应性免疫反应与肝耐受性微环境之间存在关系[32]。这种具有耐受力的微环境会导致肝脏T 细胞功能障碍，包括克隆缺失、无反应、衰老、偏离和衰竭[30]。肝脏拥有大量的肝细胞、非实质细胞和淋巴细胞，这些细胞之间复杂的相互作用有助于在肝脏中诱导适应性免疫耐受[33]。还有报道[34]称肝外组织如肾、脾、胰等检测发现HBV DNA，这些部位因无法引起有效的免疫应答，逃避宿主免疫性清除，导致病毒反复被释放，形成肝外病毒储存库，反复感染肝细胞而致慢性化感染。

2.3 宿主免疫

2.3.1 树突状细胞（DC）介导：DC 作为一种抗原呈递细胞(antigen-presenting cells,APC)，能摄取、加工、处理HBsAg，并分泌多种细胞因子参与慢性HBV感染者免疫耐受和免疫应答作用的调节[35]。同时，肝脏中包含不同的非实质细胞群，这些细胞群也可以作为APC，在效应T 细胞启动效率低下时，倾向于诱导T 细胞耐受而非T 细胞活化[36]。有报道称血清较高水平HBsAg的慢性HBV感染者外周血中DC 发育功能障碍，IFN-α,IL-6 等细胞因子水平均有不同程度的降低[37]，并且有缺陷的DC与CD56-NK 细胞相互作用可能导致抗病毒免疫反应无效，形成免疫耐受[38]。另外，SHAO 等[39]研究表明细胞因子IL-35 调节慢性HBV感染期间调节性T 细胞(T-reg)和CD8+T 细胞的功能，这可能有助于免疫耐受和病毒持久性。因此，在慢性HBV感染，DC 功能受损的情况下，低水平HBsAg 乙肝感染者体内病毒可能发生免疫逃逸，DC 无法成功摄取、加工、处理低水平的HBsAg，致使机体对低水平的HBsAg 无法产生有效的免疫应答，形成免疫耐受[40]。

2.3.2 T/B 淋巴细胞介导：慢性HBV感染与T 细胞耗竭有关[41]，表现为共抑制性受体的持续表达和细胞因子产生受损，如程序性死亡受体-1（PD-1），自然杀伤细胞受体2B4(CD244)，细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4），T 细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3（TIM-3），细胞因子CD160 等，血清高水平的HBsAg 可以诱导共抑制性受体上调，多种共抑制性受体的持续表达维持T 细胞的功能性衰竭。DOLINA 等[42]人发现，在慢性HBV感染中，通过高迁移率家族蛋白-1（HMGB-1）识别操作的病毒特异性TIM-3+和CD8+T 细胞可能会抑制肝脏微环境中的T 细胞反应，继而促进HBV 持续感染。同时，T-reg 作为CD4+T 细胞的特殊亚群，在HBV感染宿主时，通过分泌多种效应分子如IL-10,TGF-β 等，直接或间接抑制T 细胞反应，从而维持免疫耐受[43]。然而，有研究显示血清低水平HBsAg 患者较血清高水平HBsAg 患者而言，虽然CD4+T 细胞上能观察到较低的PD-1表达，但同时报道又指出CD4+T 细胞上的2B4表达没有明显差异[44]。所以，低水平HBsAg的慢性HBV感染者呈现非活动性HBsAg 携带状态，虽然机体内部分共抑制性受体较低，但T 细胞耗竭可能仍然存在，导致T 细胞功能未完全恢复，对低水平HBsAg 不能执行正常应答，形成免疫耐受，从而无法完全清除HBV。还有报道[40]指出当大量病毒感染宿主时，如果T 细胞应答不是非常强烈，那么，即使宿主产生抗病毒细胞因子，细胞毒性T 淋巴细胞也不能完全灭活HBV，最终仍会导致病毒呈现持续感染状态。也就是说，在T 细胞应答不全的情况下，低水平HBsAg 可能会逃脱免疫监视，致使宿主仍然存在较弱的病毒基因表达，从而HBV 不能被完全清除。另外，与功能障碍和衰竭相关的B 细胞也表达一系列共抑制性受体，包括Fc 受体样4（FcRL4）,PD-1和PD-L1 等，且血清低水平HBsAg 组和血清高水平HBsAg 组表达的受体无明显差异，这也可以说明低水平HBsAg乙肝感染者B细胞功能受损，可能形成免疫耐受[44]。所以，综上所述，低水平的HBsAg 可能诱导宿主T,B 淋巴细胞产生完全或不完全的免疫耐受[45]。

2.3.3 单核细胞/NK 细胞介导：NK 细胞和单核细胞介导的宿主免疫是先天免疫应答过程中的两个重要环节。有研究发现血清高水平HBsAg 慢性HBV感染者NK细胞功能缺陷，呈现失活状态[46]。LI等[47]人观察到HBV 可通过多种信号通路利用HBsAg 诱导产生抑制性单核细胞，这些抑制性单核细胞表达的人类白细胞抗原-E（HLA-E）和PD-L1 能够进一步诱导NK 细胞产生IL-10，这样的NK 细胞能够抑制宿主自身CD4+和CD8+T 细胞活化，并且HBV 也能通过单核细胞诱导调节性NK 细胞（NKreg）下调T 细胞的免疫反应，同时有报道证实慢性HBV感染者的NK 细胞可介导免疫耐受或免疫损伤[48]。还有一些研究表明[49-50]：HBsAg 可通过干扰单核细胞/巨噬细胞中的Toll 样受体（toll-like receptors,TLR）信号途径来抑制细胞因子的释放，这可能有助于建立慢性感染。然而，KIM 等[44]人研究显示血清低水平HBsAg 组和血清高水平HBsAg 组中单核细胞、NK 细胞等免疫细胞的组成无明显差异，所以，低水平HBsAg 乙肝感染者由于长期的HBV感染可能也会导致单核细胞、NK 细胞功能缺陷，同时血清HBsAg 浓度较低，可能诱使单核细胞及NK 细胞正常的识别、杀伤作用受限，从而无法有效释放抗病毒性的炎性因子及彻底抑制HBV。

2.4 年龄等其他因素 已有研究发现[51]：低水平HBsAg的HBV感染者年龄相对较高(＞50 岁)，持续低水平的HBsAg表达可能与非活动性的HBV 携带者状态有关，并随着年龄的增长而发生。YUEN等[52]也表明HBV 变异与年龄增加及HBsAg水平降低有关，HBV 多样性的增加可能导致病毒逃避免疫监视，形成免疫耐受。此外，ALLAIN 等[53]人研究表明低收入和中等收入国家，由于在资源获取方面落后于发达国家，HBV的检测及诊断技术受限，导致数十年由于医疗缺乏形成免疫耐受；虽然目前实施HBV 疫苗已降低了HBV的发病率，但仍会导致该地区HBV的垂直传播，所以，这些地区慢性HBV感染者的低水平HBsAg表达可能更易形成免疫耐受。

3 结论与展望

综上所述，慢性HBV感染者持续低水平HBsAg表达免疫耐受形成的原因多样，可能是在病毒自身适应性变异与免疫逃逸、病毒感染靶细胞、宿主免疫及其他多种因素作用下，导致机体无法完全清除低水平HBsAg。目前，有关如何打破慢性HBV感染者持续低水平HBsAg表达免疫耐受状态的研究报道甚少，但随着HBV 诊疗技术不断发展，低水平HBsAg 人群愈来愈引起肝病学、传染病学及流行病学等领域专家的关注。因此，通过研究低水平HBsAg 免疫耐受形成的机制，将为临床治疗中打破其免疫耐受状态奠定基础，从而为实现彻底清除HBV 拓展新思路。