心磷脂外化在创伤性脑损伤中的研究进展

牛 曼,王树洪,熊彬媛,姜兴宇,李玉林,刘婷婷,喻安永

遵义医科大学附属医院急诊科,贵州 遵义 563003

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)不仅严重危害患者健康，而且给家庭和整个社会造成巨大负担，从全世界范围来看，每年有超过5 000万人发生TBI，而中国TBI患者的总人数远超其他大多数国家[1]。尽管多年的基础研究已经开发出一些有前景的神经保护疗法，但均未能转化到临床，而且目前尚无有效的药物[2]。线粒体自噬(mitophagy)是细胞通过选择性自噬清除功能异常或多余线粒体的过程，它可以维持线粒体质量及功能的稳定，从而在TBI中发挥神经保护作用[3]。在哺乳动物中，已经鉴定出了不同的线粒体自噬效应因子，如类NIP3蛋白X(NIP3-like protein X,Nix)、Bcl-2/腺病毒E1B19-KDa-相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein3,BNIP3)、携带FUN14结构域蛋白1(FUN14 domaincontaining protein 1,UNDC1)、Bcl-2类蛋白13(BCL2-like 13,BCL2L13)、心磷脂(cardiolipin,CL)和PTEN诱导激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)等[4]。Chao等[5]首次证明在人类和大鼠的受伤大脑中，CL外化介导的受损线粒体的靶向自噬参与了TBI早期受损细胞器的清除。因此对CL外化的进一步研究，可能是改善TBI治疗结果的潜在策略。

1 CL的概念

CL是线粒体特异性磷脂，具有独特的二聚体结构，含有4个酰链和2个与甘油相连的磷脂酰基[6]。CL在线粒体内膜(inner mitochondrial membrane，IMM)的基质侧合成[7]，几乎只存在于线粒体膜内，占所有磷脂的20%。CL的功能体现在多个方面：线粒体膜的构造、蛋白质的引进、生物能量、线粒体动力学和线粒体自噬[8]。所以CL代谢的缺陷会导致线粒体结构的改变，包括嵴的丧失、氧化磷酸化降低、线粒体DNA不稳定、线粒体形态和动力学改变及线粒体自噬能力的降低[9-11]。TBI增加了大脑能量需求，导致线粒体呼吸链激活，进一步使活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成增加，这一系列事件通过氧化CL来触发神经元凋亡。神经细胞避免凋亡的一个途径是通过线粒体自噬消除受损的线粒体，研究结果表明，TBI后由CL引导的线粒体自噬是一种内源性的神经保护过程，标志着受损的线粒体被消除，从而限制神经元死亡和行为缺陷[5]。

2 CL引导的线粒体自噬在TBI后的神经保护作用

2.1CL过氧化促进细胞凋亡 TBI后大脑能量需求增加，线粒体呼吸被激活，从而导致ROS生成增加，此时CL被氧化，导致细胞凋亡，使神经细胞功能丧失，进一步加重颅脑损伤[5]。这个氧化过程是CL与细胞色素c(Cytochrome C，Cytc)相互作用实现的。Cytc是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白质，是在呼吸链中电子传递必需的一类色素蛋白，其参与呼吸作用。另一方面，膜结合的Cytc已被确定为细胞凋亡的活化剂[12]。CL与Cytc相互作用形成过氧化物酶复合物，催化CL过氧化，过氧化的CL在OMM上的聚集导致Bcl-2相关X蛋白(Bax)的募集和线粒体通透性转换孔(MPTP)的形成，MPTP将包括Cytc在内的线粒体促凋亡蛋白释放到细胞质中，在细胞质中，Cytc促进凋亡体组装，从而触发细胞凋亡[13-14]，进一步导致神经细胞的功能丧失，从而加重颅脑损伤。CL是唯一在凋亡过程中发生过氧化的线粒体磷脂，它与Bcl-2家族蛋白相互作用，使线粒体外膜通透性增加，导致Cytc的释放[15]。研究证实，对乙酰氨基酚可以减少CL的过氧化，最大限度地减少细胞凋亡[16-17]，且对乙酰氨基酚可以诱导CL重塑[18]。研究发现核糖体生物发生因子Peter Pan(PPAN)的缺失会导致自噬途径和细胞凋亡的失衡[19]。向线粒体输送小分子抑制剂、电子清除剂，既可以防止大量心磷脂氧化产物的积累，也可以防止颅脑损伤[20]。截短型Bid基因(T-Bid)可能与Cytc竞争CL，导致Cytc从膜上释放，从而停止CL的氧化[21]。含有C22∶6的CL是TBI后引起的氧化损伤的一个特异的、早期的和显著的靶点，提示CL氧化产物可能是脑内细胞早期凋亡的生物标志物信号，也是急性治疗的关键靶点[22]。Kagan等[6]表示氧化反应可能通过导致线粒体损伤和氧化脂质的积累来间接促进线粒体自噬。通过对CL过氧化导致细胞凋亡的机制的研究，可能找到治疗TBI的有效治疗靶点。

2.2CL外化到线粒体表面作为消除信号引起线粒体自噬 Erlich等[23]首先证明自噬在TBI中起保护作用。Chao等[5]首次证明在受伤的人类和大鼠的大脑中，线粒体自噬参与了TBI早期受损细胞器的清除，CL外化到线粒体表面，作为受损线粒体清除的标志物，诱导线粒体自噬清除受损线粒体，从而抑制细胞凋亡，这一系列过程减轻了神经元细胞的死亡和相关的行为缺陷。

2.2.1CL与核苷二磷酸激酶D(NDPK-D)结合外化:NDPK-D或NME4(非转移性表达的异构体4)，也被称为NM23-H4，是形成定位于线粒体膜间间隙的大的同源六聚体复合物[24]，其结合CL并促进其重新分布到线粒体膜外膜[25-26]。NDPK-D通过在膜间隙形成六聚体，在物理上连接IMM和线粒体外膜(outermitochondrial membrane，OMM)，所以NDPK-D可能在物理上促进CL从IMM外化到OMM[6]。视神经萎缩1(optic atrophy l，OPA1)是IMM融合和嵴形成所必需的GTPase蛋白，OPA1与某种蛋白相互作用参与将NDPK-D的激酶功能转换为CL-转位酶活性[25]，促进CL从IMM到OMM的转位。由于NDPK-D具有产生核苷三磷酸盐和促进CL转移的双重功能，并且与OPA1紧密结合，通过OPA1为其提供GTP，因此NDPK-D是一个决定线粒体自噬反应的十分关键的整合位点[27]。此外，CL还与其他线粒体自噬相关的蛋白相互作用。例如，自噬相关蛋白Beclin 1直接与OMM上的CL结合，以诱导或抑制线粒体自噬[28]。心磷脂酰基转移酶1(Acyl-CoA:lysocardiolipin acyltransferase-1,ALCAT1)可以在多种衰老相关疾病中催化CL的病理重塑[29]，去除ALCAT1显著增强了线粒体自噬的吞噬作用[30]。Tafazzin蛋白(TAZ)是一种CL重塑转酰化酶，在不影响自噬小体生物发生的情况下调节线粒体功能和线粒体自噬的功能[31]。研究发现，卡路里限制(calorie restriction，CR)促进广泛的线粒体膜重塑，降低氧化损伤的脂质，增加心磷脂水平和重新分配心磷脂[32]。综上所述，对CL外化相关蛋白的研究，可能发现新的药物靶点，从而调节线粒体自噬，进一步减轻脑损伤。

2.2.2CL与线粒体肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，mtCK)相互作用外化:mtCK与含有心磷脂的膜具有高亲和力。mtCK在线粒体中含量非常丰富，占线粒体蛋白质的1%，它是一种多任务蛋白，定位于线粒体膜间间隙，是跨越线粒体膜的八聚体，与CL特异性结合[33]。当CL异常时，mtCK不能作为转运体发挥作用，这表明CL对于mtCK的稳定有重要作用[21,34]。mtCK可能通过膜脱水导致线粒体膜界面水的丢失，从而促进脂质转移[21]。mtCK通过磷酸肌酸穿梭机制参与线粒体和胞浆之间的能量转移，并且在维持线粒体膜结构方面具有额外的作用[33]，它还调节线粒体通透性转换孔，其氧化会破坏能量平衡，膜通透性转换孔打开，从而导致细胞凋亡[35]。mtCK 和NDPK-D非常相似[21]，这两种激酶都具有两种功能，即通过强的心磷脂相互作用与内膜ANT和线粒体呼吸的功能偶联，以及膜间脂质转移，它二者可能有相同的CL从IMM到OMM的转位方式。CL通过NDPK-D和mtCK从线粒体内膜外化到线粒体外膜，然后与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1light chain 3，MAPlLC3/LC3)相互作用介导线粒体自噬过程。

2.2.3CL外化与LC3结合:CL外化到线粒体表面可以促进线粒体自噬。Chu等[36]发现，在初级皮质神经元和SH-SY5Y细胞中，鱼藤酮、星孢素、6-羟基多巴胺可以导致心磷脂外化到线粒体表面。CL从从线粒体内膜转运到线粒体表面，至少需要3次移位：(1)从IMM的内小叶到OMM的外小叶;(2)从IMM的外小叶到OMM的内小叶;(3)从OMM的内小叶到OMM的外小叶[37]。这一过程涉及磷脂扰乱酶3(phospholipid scramblase-3，PLS-3)，负责CL从IMM到OMM的移位并伴随自身的磷酸化，PLS3缺乏通过抑制CL外化减弱TBI诱导的线粒体自噬[5]。

因线粒体损伤而外化的CL与自噬蛋白LC3相互作用，介导初级神经元和转化的神经细胞中线粒体的靶向自噬[36]。LC3是自噬标志物，自噬信号诱导后，胞浆型LC3(即LC3-I)与磷脂酰乙醇胺共价脂化形成膜相关的LC3-II，自噬的“货物”受体将“货物”带入正在形成的吞噬体，并通过LC3相互作用区(LIR)域与LC3结合，最终形成自噬体[38]。最新研究表明，TBI诱导的线粒体自噬，通过CL外化作为消除受损线粒体的标志物是有益的，因为它减轻了神经元死亡和相关的行为缺陷[5]。CL的重新分布是线粒体自噬的信号，它通常定位于线粒体膜内，当存在线粒体损伤、去极化和其他损伤信号时，很大一部分CL移位到线粒体膜外表面，在OMM表面形成了一个重要的平台，在那里CL与存在于吞噬体上的酵母中自噬相关基因8(Atg8)的同源物-LC3的特定位点(几个碱性氨基酸簇)结合，促进炎性小体的激活，并刺激线粒体通过线粒体自噬来清除受损或无功能的线粒体[36,39-40]。LC3将同时介导线粒体识别和自噬小体的形成，最终导致受损线粒体的移除[41]。线粒体自噬对于神经元细胞来说是一把“双刃剑”，LC3结合位点有一个重要特征，它可以被cAMP依赖的蛋白激酶PRKACA/PKA (protein kinase,cAMP-dependent,catalytic,α)磷酸化，该位点靠近一对精氨酸，用于线粒体自噬。Chu等[40]预测通过在这个区域增加负电荷，将有助于减弱LC3与CL的结合作用，从而提高触发线粒体自噬的阈值。值得注意的是，LC3介导的CL识别不依赖于氧化，非氧化性CL的外化足以触发线粒体自噬。CL过氧化，导致持续的伤害或过量的ROS产生，可能有助于将CL相关的线粒体信号从线粒体自噬转变为细胞程序性死亡[40]。CL过氧化导致细胞凋亡，而细胞避免凋亡的途径包括CL外化引导的线粒体自噬，或许通过对线粒体不同生理状态下的研究，可以发现TBI有效的治疗靶点。

3 总结与展望

尽管近年来实验性研究已经开发出了一些可能有效的神经保护疗法，但是在临床的实际应用仍无进展，科研工作者和临床医师都在积极探寻有效的治疗方法。本篇总结了和CL外化引起线粒体自噬有关的几种相关蛋白，针对这种脂质-蛋白质的相互作用的研究，可能为未来的研究提供一种新方向。CL既参与线粒体自噬又在神经细胞凋亡中发挥重要作用，所以对CL的进一步研究可能为TBI提供有效治疗靶点。关于线粒体脂质的研究已经取得了许多进展，但CL外化的具体机制仍需进一步探究，并且对正常CL代谢的途径还知之甚少。因此，通过对CL的进一步研究，可能会在TBI治疗方面发掘无限潜能。

作者贡献声明:牛曼：选题设计，文章撰写；喻安永：提供研究经费与指导性支持；王树洪、熊彬媛、姜兴宇、李玉林、刘婷婷：整理文献以及采集整理数据