纳米载体药物的溶酶体逃逸机制及合成修饰研究进展

闫 洁，余真妍，杨洪宾，纪帅帅，霍 强，程 秀

(蚌埠医学院药学院，安徽 蚌埠 233030)

载体可以显著改善药物降解，高效地将药物传递到靶细胞提高疾病治愈率，相比于传统药物的递送纳米载体效果更佳。其中，纳米载体是一种纳米级微观范畴的药物控释体系，能够穿透生物屏障、提高生物相容性和延长循环时间，并通过保护药物、靶向输送来改善药物的传递。纳米载体进入细胞后，经膜泡包被于内体中并传递进入溶酶体，最后经溶酶体逃逸成功释放到细胞质中。在逃逸过程，纳米载体保护其负载的药物避免被溶酶体内的酸性水解酶降解[1]，这一关键步骤是纳米颗粒在细胞内输送治疗性药物的限速步骤。随着载体材料的设计，我们必须了解纳米药物在细胞中的行为并克服这一障碍。因此全面认识纳米载体逃逸溶酶体的机制，对于提高纳米载体的转运效率具有重要的指导意义。

溶酶体膜孔洞是通过膜张力和线张力的作用形成。当膜张力大于线张力时形成孔洞，线张力大于膜张力时孔洞关闭，如多肽类细菌外毒素在pH为7时呈无规则线圈结构[2]。随着pH的下降，多肽中质子化的氨基酸与溶酶体膜有较高的亲和性，导致线张力减少而形成孔洞并保持孔洞的稳定[3]。溶酶体膜孔隙形成固有地限制了分子大小，使药物的释放受到孔隙的限制，但实现了由细菌外毒素介导的溶酶体逃逸。

1 溶酶体逃逸机制

1.1 质子海绵效应“质子海绵效应”是纳米载体药物进入溶酶体后，会吸收大量H+，导致跨膜电压不同，从而使膜上质子泵持续开启。为达到电荷平衡，细胞质中的无机离子如氯离子内流，质子积累与氯离子的流入相耦合，随着离子浓度的增加溶酶体内渗透压大于细胞质中渗透压[4]。为维持渗透压，细胞质中的水内流入溶酶体，水的流入及聚合物的溶胀使溶酶体破裂，破裂的内容物被释放到细胞质中[5]，从而促进药物的保护与释放。其中，具有强缓冲能力的，能大量吸收质子的载体材料起主要作用。因此，具有质子海绵效应的纳米载体可以促进负载的药物进行溶酶体逃逸，成为诱导溶酶体逃逸的常用策略。

1.2 溶酶体膜的融合纳米药物可以通过与膜融合诱导逃出溶酶体，将药物运输到细胞质。膜融合材料在中性条件下稳定，在酸性条件下可与溶酶体膜融合。将膜融合材料结合到纳米药物载体中，溶酶体细胞质侧的阴离子脂质重新排列，与纳米载体的阳离子脂质形成中性离子对，使膜不稳定，帮助药物逃离溶酶体，实现药物的释放[6]。

1.3 光化学内化光化学内化(photochemical internalization，PCI)是光敏剂分子经特定波长的光照射后发生光化学反应，将光能转化为分子内能，继而在有氧条件下产生活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)使溶酶体中的物质避免降解并释放到细胞质中。溶酶体的PCI是将合适的光敏剂滞留在靶向细胞的内吞囊泡中与治疗剂配合使用，被光激活后光敏剂产生的ROS能诱发细胞器的选择性损伤和破坏内吞囊泡膜，触发治疗剂的溶酶体逃逸从而释放内吞药物[7]。这允许被包裹的分子逃脱并到达细胞内，同时细胞本身的生存能力未受到影响。

2 合成逃逸溶酶体的纳米载体药物

为了实现纳米载体药物逃逸溶酶体，研究者们根据上述不同的溶酶体逃逸机制，构建了多肽、毒素、脂质、聚合物和光敏剂集成的纳米载体，这些纳米载体的构建对临床实践具有重要的借鉴意义。

2.1 多肽(穿膜肽)以pH敏感性肽[8]或富含精氨酸的细胞穿透肽、GALA肽(glutamic-alanine-leucine-alanine acid，GALA)[9-10]修饰的脂质体是药物输送领域最常见的工具。这些肽诱导脂质双层膜重新调节成多层，使膜不稳定，导致膜融合和孔隙的形成，协助纳米颗粒内体逃逸促进药物释放。最近阳离子寡肽作为非病毒基因递送载体引起了广泛的关注，但是其低转染效率限制了其进一步的应用。Wang[11]等通过使用八-D-精氨酸和四-L-组氨酸形成二硫键交联的嵌合多肽，创建了一个高效基因载体，使用该载体递送治疗性基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，以查看该基因是否可以转移，并在体内外发挥抗肿瘤作用。结果表明，新设计的含有多肽的载体能够有效地将DNA浓缩成纳米复合体，实现跨膜转运，促进其内体逃逸。

2.2 毒素毒素是从生物体中分离出来的剧毒物质，在过去几年里已经证明这些毒素能通过形成孔或与膜融合克服内体逃逸障碍来促进基因表达。并且一些毒素能与纳米颗粒结合以促进纳米药物的传递[12]。如单核增生细胞李斯特菌能够分泌一种李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)毒素，在感染时逃离真核溶酶体系统，使其能够在宿主细胞内安全生长和增殖[13]。将李斯特菌溶血素O对脂质体修饰后增强了内容物从溶酶体到细胞质的释放[14]。Plaza-Ga[15]等提出了利用纯化的His-LLO H311A突变体蛋白及其在纳米颗粒表面的结合来促进40 nm纳米颗粒在小鼠胚胎成纤维细胞中的溶酶体逃逸。用腈基乙酸对纳米颗粒进行特异性功能化后，实现了LLO的表面固定化，使组氨酸标记的蛋白质能够特异性结合。由于内体的酸化使LLO蛋白从纳米颗粒表面释放，并自组装到能穿透内体/溶酶体膜的孔中，最终纳米颗粒得以逃逸。

2.3 脂质脂质通过内吞途径内化到细胞中并降解成脂质体，脂质体作为非病毒递送系统的主要载体之一，也是目前研究最广泛的将治疗药物递送到细胞内的纳米技术工具。然而，纳米颗粒的溶酶体逃逸成为开发这项技术的主要障碍[16]。因此需要开发出利用脂质等载体使纳米颗粒从内体逃逸到胞质的高效药物传递。环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cyclic arginine-glycine-aspartic acid，cRGD)肽被广泛地用作肿瘤靶向配体。Wang[17]等将DSPE-PEG2000-cRGD的后插入策略应用于由双子样阳离子脂质(cationic lipid，CLD)和中性胞嘧啶包裹的3',3"-双肽-siRNA(pp-siRNA)纳米粒子。结果表明PP-siRNA/CLD/DNCA/DSPE-PEG2000-cRGD(PCNR)的纳米颗粒能够特异性靶向整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞。此外与pp-siRNA/CLD/DNCA/cRAD(PCNA)的非靶向纳米复合物相比，它可以有效下调相关蛋白水平、抑制A375细胞的细胞增殖。PCNR的摄取途径主要取决于细胞中的内吞和巨胞饮作用，它们可以绕过溶酶体或迅速导致溶酶体逸出以减少siRNA降解。表明脂质纳米载体增加了siRNA的递送并提高了转染效率。Qiao[18]等采用基于RNAi的免疫调节来改变肿瘤的免疫微环境的阻碍并提高化疗效果。此次研究建立了具有双重靶向性和ROS响应的纳米治疗系统Angiopep LipoPCB(Temozolomide+BAP/siTGF-β)，ALBTA递送替莫唑胺用于颅内成胶质细胞瘤治疗。本研究中的纳米颗粒展现出了良好的载药率和稳定性，可以有效地穿透血脑屏障，并通过受体介导的胞吞作用靶向胶质母细胞瘤细胞保护siRNA不被降解。ALBTA中的两性离子脂质(二硬脂酰磷酸乙醇胺-聚羧基甜菜碱脂质)可促进内体/溶酶体逸出，从而增强替莫唑胺的细胞毒性并提高siTGF-β的基因沉默效率。ALBTA显著改善了免疫抑制微环境，并延长了胶质瘤小鼠的生存时间。其中，二硬脂酰磷酸乙醇胺等融合脂质并入脂质复合物中附着于阴离子膜上并与之融合来增加脂质体和内体膜之间的相互作用促进内体释放，使药物成功进行溶酶体逃逸。

2.4 聚合物聚合物是由重复结构单元大分子组成的，通常以共价键结合。近年来阳离子聚合物由于其独特的化学物理性质，在基因传递及药物传递方面受到了广泛的关注。目前可供选择的聚合物中包括聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、树枝状聚合物、阳离子聚合物、支化聚乙烯亚胺(branched-polyethyleneimine，BrPEI)和壳聚糖等。聚合物与纳米颗粒相容形成复合物，并且这些聚合物能增强药物的稳定性、高效递送和调节释放。大多数基于聚合物的纳米颗粒通过内吞途径进入细胞，并被包裹在内体中。为了防止纳米颗粒的降解，研究者们最近采用了不同的聚合物来修饰纳米颗粒，使它们可以从内体逃逸到细胞质中[19]。目前，基因疗法和化学疗法的结合在癌症治疗中受到了很大的关注。由于低转染效率和基因从纳米载体的内体逸出能力差，严重限制了小干扰RNA(siRNA)在临床上的成功应用。Cao[20]等在研究中设计了一种新型的pH响应，表面修饰的单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNT)用于阿霉素(doxorubicin，DOX)和survivin siRNA的基因传递。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)与甜菜碱共价缀合，然后将所得的聚乙烯亚胺和甜菜碱复合物(polyethyleneimine betaine，PB)与氧化的SWCNT进一步合成以形成SWCNT-PB(SPB)，从而表现出优异的pH响应性溶酶体逃逸性。Liu[21]等为克服基因传递中不同的细胞内外的屏障，通过模块化自组装策略制备了具有电荷转化性质的肿瘤靶向和pH/氧化还原反应性三元复合物。其中多聚体的ζ电位在生理pH值下是稳定的，并且在pH5.5(内/溶酶体pH)条件下从-14 mV迅速增加到+20 mV，这是由于酸敏感中酰胺键的断裂，以及随后对FA-PEI-AcO层的去屏蔽作用，导致复合体的内/溶酶体逸出。Chen[22]等开发了一种独特的pH/氧化还原双敏感阳离子单分子纳米颗粒(nanoparticles，NP)，可实现内体/溶酶体逸出以及靶细胞内部siRNA的分解，可用于肿瘤靶向的siRNA递送。这些研究表明了设计聚合物纳米颗粒在溶酶体逃逸中的重要作用，能更好地将药物输送到细胞中。

2.5 光敏剂光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏剂(photoinitiator，PI)在适当波长的光照射下产生有毒的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，产生的ROS主要是单线态氧可以破坏溶酶体，单线态氧的寿命很短，破坏范围有限。因此，它可以破坏内质体/溶酶体膜，并且在不影响细胞器的情况下释放治疗内容物。目前利用光敏剂的辅助作用已经成为了一种用来增强生物大分子及药物传递的高效的癌症治疗方法。这项技术基于光激活内吞光敏分子，在将内吞囊泡内容物转移到溶酶体之前诱导其释放。Liu[23]等为了克服内源性/溶酶体的限制，提高纳米药物的临床可利用性，设计了一种基于与脂质双层结合的介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticles tethered with lipid bilayers，MSN@TLB)的近红外(near-infrared，NIR)刺激响应纳米体系。在该纳米体系中，亲水性药物分子唑来膦酸(zoledronic acid，ZOL)首次通过聚乙烯亚胺修饰进入介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)。为了防止运输中有效载荷的泄漏，脂质双层(lipid bilayers，LB)壳通过聚乙烯亚胺缓冲共价拴在MSN核上，大大提高了LB的稳定性。同时，在疏水室中引入疏水光敏剂IR-780，使体系具有光活化性能。在808 nm照射下，细胞内化和内体/溶酶体捕获后，通过局部ROS的产生使光化学内化介导的药物产生释放和溶酶体逃逸，从而实现高效的肿瘤光动力治疗。另外Zhao[24]等将抗癌药物阿霉素(doxorubicin，DOX)和光敏剂二氢卟吩(chlorin e6，Ce6)负载到带相反电荷的含有阳离子的聚合物中，阳离子聚合物与阴离子Ce6之间的静电吸引，表明Ce6具有比DOX更高的负载效率。在酸性条件下，由于质子化DOX的溶解度增加，与部分质子化聚合物的相互作用减弱，DOX呈现pH响应性药物释放。相反，Ce6由于溶解度变化较小以及Ce6与聚合物之间的相互作用强烈而表现出对pH不敏感的释放。通过光触发活性氧，增强细胞摄取和载药纳米粒子的有效内体/溶酶体逃逸，实现了肿瘤细胞的协同化疗/光动力治疗。

3 总结与展望

大多数纳米颗粒通过内吞途径进入细胞内，不可避免的被溶酶体中存在的水解酶降解，导致药效降低，因此我们必须对其进行改造修饰。目前常用的载体如毒素和穿膜肽，其能通过成孔或与膜融合克服溶酶体逃逸，毒性较大以及转染率不高限制了其使用。脂质生物相容性好并且能够减少药物降解，但极易发生免疫反应。聚合物作为纳米载体可以提高药物生物利用率，但聚合物降解不稳定。以及光敏剂虽然可以提高靶向性降低药物毒性，但成分复杂稳定性差的特点导致其使用不方便。以上纳米载体虽可实现溶酶体逃逸，但均有一定的优缺点。因此，必须了解不同类型的溶酶体逃逸机制，利用各种方法对不同类型的纳米颗粒进行修饰，从而开发出能够成功逃逸溶酶体的理想载体。目前，合成逃逸溶酶体的纳米粒子仍然面临很大的挑战，需要研究者们进行深入的研究。