p16及其与皮肤肿瘤关系的研究进展

邓宁宁，马志红

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院皮肤科，黑龙江 牡丹江 157011)

肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程，是一类多阶段的、多基因、多因素、多途径导致的细胞周期调控机制受损的疾病，其中癌基因与抑癌基因的表达和调控异常是肿瘤的发生、发展乃至转移的重要原因之一。p16是一种继抑癌基因p53之后发现的另一种最常见的肿瘤抑制基因，p16基因产物是分子量为16000的蛋白质，是一种细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和CDK6的抑制物，在调控细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡中发挥重要作用[1]。本文就p16的结构、功能、作用机制及其与皮肤肿瘤关系的研究进展进行简要综述。

1 p16的结构

p16又称为多种肿瘤抑制因子1(MTS-1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4a抑制剂(INK4a)或细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(p16INK4a和CDKN2A)，是一种肿瘤抑制因子，是位于人类染色体9p21.3的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂INK家族的成员[1-2]。Serrano等人[3]于1993年使用酵母双杂合蛋白相关性筛选法研究CDK4作用的相关性蛋白时，第一次发现了p16基因，并克隆了p16的互补DNA。1994年Kamb等人[4]报道的一种多种肿瘤抑制因子，是运用染色体移位技术和定向测序技术发现黑色素瘤细胞系染色体9p21位点存在基因缺失和突变，将这种基因称为p16基因。p16基因座位于9p21.3，全长8500bp,由外显子1α、1β、2、3和3个内含子构成，是一种含148个氨基酸残基、分子量约为16000的细胞周期相关的调节蛋白[5]。

2 p16的作用机制

真核细胞的细胞周期，一般分为间期和分裂期(M期)，其中间期又分为三期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。细胞周期中的每个阶段都有其复杂的生化变化，其中G1→S期和G2→M期这两个阶段处在复杂活跃的分子水平的时期，是细胞周期中极其重要的两个阶段，尤其G1→S期的调控。p16是细胞周期的调节因子，它作用于pRb(视网膜神经母细胞瘤蛋白)上游，能抑制CDK4/6(cyclin D依赖的蛋白激酶4/6)，能使pRb保持低磷酸化，细胞停滞于G1期，主要是通过p16-Cyclin D1-CDK4/6-pRb途径来实现调控细胞周期的。而CDK4/6只有在与cyclin D1结合后才有活性，CDK4/6与cyclin D1结合后能使Rb磷酸化，磷酸化后的Rb将与转录因子E2F解离，游离并活化的E2F入核内，激活G1→S转换，合成S期必需的基因产物(cyclin B1, dihydrofolate reductase, JUNB and others)，从而加速了细胞周期以及促进细胞增殖。另外p16蛋白能与cyclin D1蛋白竞争性结合CDK4/6并阻断CDK4/6与cyclinD1结合形成复合体，从而Rb不能磷酸化，E2F不能游离活化，所以细胞增殖会受到抑制。由此可见p16不仅能调控细胞周期，还可以抑制细胞增殖[5-6]。

3 p16基因结构及功能的异常

目前研究发现在多种肿瘤中存在p16基因失活，并且发现p16基因失活与肿瘤的发生发展甚至预后有密切关系。引起p16基因失活的遗传改变包括突变、纯合缺失、启动子过甲基化，其中最常见的遗传改变是纯合缺失和启动子过甲基化。p16基因启动子甲基化及累及p16基因的点突变常常不影响p16基因的活性[7-8]。有研究表明，p16蛋白的低表达与癌症患者的预后有关，比如卵巢癌、食管癌、口咽部鳞癌、乳腺癌等。

3.1 基因突变基因突变指的是DNA序列发生的碱基替换，一般包括少量碱基的插入或缺失，又称为点突变p16基因突变主要包括剪接位点突变、部分核苷酸碱基序列缺失、重新排列、位移或插入其他碱基序列。但是一般认为p16基因发生突变的概率远低于纯合缺失和启动子过甲基化。Hardie L J等[9]探讨食管癌p16 mRNA表达与p16基因突变、缺失之间的关系时发现p16突变不常见，仅占2%，但是在43%的组织学正常上皮中及85%的肿瘤样本中检测到了p16基因启动子过甲基化。

3.2 基因缺失缺失主要表现为纯合缺失和杂合缺失。p16基因发生纯合缺失时会导致细胞内p16 mRNA和p16蛋白均不能表达；而p16基因发生杂合缺失时，没有发生缺失的部分基因可以正常表达，但如果这一部分基因发生甲基化修饰或突变，会使细胞内p16基因失活、蛋白水平下降。López等[10]在27个原发性喉鳞状细胞癌和20个健康粘膜样本的充分表征的系列中研究了p16基因，使用甲基化特异性确认异常启动子高甲基化，同时发现除了3个 (11%) 之外，所有研究的样本都在9p21段出现损失，这最常见的发现是p16基因座的小缺失(外显子1α)(44%)。

3.3 启动子过甲基化DNA甲基化是由DNA胞嘧啶甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)来催化的，可以将甲基从一个S-腺苷甲硫氨酸上转移到胞嘧啶的C-5位置上。DNA甲基化几乎特异地发生在CpG核苷处，CpG核苷在基因组中并不是随机分布的，相反，基因组中存在着CpG核苷富集的区域，称为CpG岛。抑癌基因5’端启动子区CpG岛的高甲基化导致的基因表达失活是多种肿瘤发生发展过程中的一个主要事件。因此，DNA甲基化越来越被认为是一种有前途的表观遗传和诊断生物标志物。Jae Jun Lee使用甲基化特异性聚合酶链反应和免疫组织化学方法，评估231例浸润性乳腺癌和90例导管内癌标本中p16基因的甲基化状态和p16蛋白表达水平，结果示p16基因启动子经常过甲基化，不仅在侵袭性肿瘤样本中，而且在导管内癌样本中也是如此，研究还发现p16基因的启动子高甲基化与p16蛋白表达之间没有明确的关联[11]。多项研究表明，启动子过甲基化会导致淋巴瘤中p16蛋白表达的丧失。Robaina等人在51个淋巴瘤肿瘤样本中使用焦磷酸测序研究了CDKN2A甲基化，在72.5%的样本中发生了CDKN2A启动子的甲基化，而在约41%的样本中仍未检测到p16蛋白的核表达，甲基化与CDKN2A mRNA缺失之间存在关联。在这项研究中，处于III / IV期32个患者样本中(80%)检测到CDKN2A启动子甲基化[12]。

4 p16与皮肤肿瘤

4.1 瘢痕疙瘩瘢痕疙瘩是继发于皮肤损伤后组织过度纤维修复形成的良性皮肤肿瘤，主要表现为结节样皮损，或呈蟹足样向周围扩展，超出原损伤范围。有研究表明瘢痕疙瘩中存在成纤维细胞的过度增殖、细胞外基质大量沉积和向正常皮肤组织侵袭生长的特征。季江等[13]采用免疫组化法、实时荧光定量PCR法以及亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP法)对瘢痕疙瘩皮损中的p16蛋白表达情况、DNA甲基转移酶mRNA表达情况以及p16基因的甲基化状态进行检测，结果示瘢痕疙瘩皮损中p16基因mRNA表达较正常皮肤低、瘢痕疙瘩中DNA甲基转移酶mRNA表达水平较正常皮肤高，且瘢痕疙瘩中p16启动子区甲基化水平明显高于正常皮肤组织，由此可以认为瘢痕疙瘩中p16甲基化及其低表达情况与其发生发展可能存在一定联系。Limandjaja研究发现肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩都表现出衰老标记物p16表达增加，并分布在整个瘢痕区域，提示成纤维组织的异常增殖可能与p16蛋白有关[14]。

4.2 脂溢性角化病脂溢性角化病( Seborrheic keratosis,SK) 是一种常见的良性的皮肤肿瘤，好发于中老年人，主要是因角质细胞成熟迟缓所致。Smolyannikova等通过免疫组织化学对130名SK皮损检测p53、p16和Ki67的表达，结果示超过50%的皮损中p16过表达，且在高细胞增殖活性的情况下，p53、p16的表达显着增加，刺激性SK可能存在恶性肿瘤转化[15]。在SK中发现的细胞周期调节蛋白表达紊乱提示肿瘤抑制因子激活和角质形成细胞衰老。彭程、施岩等[16]应用免疫组化法检测p16蛋白在50例脂溢性角化病皮损和10例正常皮肤组织中的表达情况，结果示78% (39/50)皮损中p16表达在表皮细胞全层，而正常皮肤组织仅40%少量表达在颗粒层，提示p16蛋白的表达可能参与了SK的发病。

4.3 皮肤鳞状细胞癌皮肤鳞状细胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma)又称为棘细胞癌，是一种常见发生于上皮细胞的皮肤恶性肿瘤，发生率仅次于基底细胞癌，但是转移的风险却高于基底细胞癌，其发生机制主要与紫外线照射、化学致癌物、病毒感染(HPV16、18等)及遗传等有关。有研究证实紫外线可以诱导皮肤癌患者皮损中p16/CDKN2A的表达降低[17]。Lisa N Tyler等[18]使用免疫组织化学确定了光化性角化病、原位鳞状细胞癌和皮肤浸润性鳞状细胞癌中p16表达的增加，发现在非肿瘤性和恶性皮肤病变中p16基因启动子过甲基化的频率非常低(6%)。齐淑贞等[19]使用PCR法、western blot及甲基化特异性PCR对皮肤鳞状细胞癌组织分别检测了p16 mRNA表达、p16蛋白表达以及p16基因启动子甲基化情况，结果为皮肤鳞状细胞癌组织中p16 mRNA及p16蛋白较正常皮肤组织低表达，而甲基化阳性率高于正常皮肤组织，提示了p16 mRNA及p16蛋白低表达情况可能与鳞状细胞癌的发生发展有关。

4.4 皮肤基底细胞癌皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma)又称为基底细胞上皮瘤，是一种局部侵袭性缓慢生长的皮肤恶性肿瘤，很少发生转移，其发病机制尚不完全清楚。有研究证实p16蛋白低表达可能参与了基底细胞癌的发生。范林明等人[20]使用免疫组化技术对54例基底细胞癌组织检测p16蛋白的表达情况，结果示p16蛋白呈现为低表达，提示p16可能与基底细胞癌的发生发展有着密切的联系。Kanellou等[21]对基底细胞癌组织中肿瘤抑癌基因p16 mRNA表达水平进行了研究，并与正常皮肤组织进行对比，结果示p16 mRNA表达水平低于正常皮肤组织，且p16基因测序存在突变情况，亦可能使蛋白表达水平降低。也有一些研究表明p16蛋白在基底细胞癌中过表达情况[22]，提示了p16蛋白过表达可能与其预后有关。

4.5 黑素瘤黑素瘤(melanoma)是一种来源于黑素细胞的恶性程度较高的恶性肿瘤，其发病率约占所有皮肤肿瘤的4%，而占所有皮肤恶性肿瘤相关的死亡率高达80%，是人类最致命的癌症之一。抑癌基因p16/CDKN2A仍然是家族性黑素瘤中最常见的改变基因，有研究表明它的发生与抑癌基因p16/CDKN2A的缺失相关[23-24]。Ming Bai等[25]的实验研究证实CDKN2A (p16INK4A) 和 CDKN2A (p14ARF) 过表达抑制黑色素瘤A375细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。王双双等[26]通过免疫组化技术检测Spitz痣和黑素瘤皮损中p16蛋白表达情况，结果示Spitz痣皮损中p16蛋白高表达，而黑素瘤皮损中表达缺失。

4.6 paget病又称为湿疹样癌，是一种少见的皮肤肿瘤，好发于乳房、阴囊及会阴等处，其病因仍不太清楚。Gloria Zhang等人[27]通过免疫组织化学方法检测了40例原发性外阴paget病中p16的表达，其中90%患者有p16表达，提示p16的表达与疾病的进展相关；同时还观察上皮内原发性外阴paget病主要具有细胞质p16免疫反应性，而细胞核p16免疫反应性主要见于侵袭性原发性外阴paget病，结果提示p16表达可能参与原发性paget病的发病机制和疾病进展。

4.7 原发性皮肤T细胞淋巴瘤原发性皮肤T细胞淋巴瘤(primary cutaneous T cell lymphoma)，又称蕈样肉芽肿，是起源于T细胞的可累及淋巴结和内脏的一种皮肤原发的淋巴瘤。张春雷等[28]在研究中发现皮肤T细胞淋巴瘤细胞显示出致癌基因(bmi-1和ras基因)和肿瘤抑制基因(p16基因)表达的变化，从而增加增殖。崔成军等人[29]使用免疫组化技术和PCR法研究了蕈样肉芽肿的p16蛋白表达及其甲基化状态，结果示蕈样肉芽肿中存在p16蛋白表达缺失，且71.43%患者出现p16基因启动区CpG岛异常甲基化，提示了p16在蕈样肉芽肿的起病或者疾病进展过程中起着一定的作用。

5 结语

p16是一种继抑癌基因p53之后发现的肿瘤抑制基因，主要是通过p16-Cyclin D1-CDK4/6-pRb途径来实现调控细胞周期的。目前已有研究发现在多种肿瘤中存在p16基因失活和p16蛋白的低表达，并且发现p16基因失活及低表达与肿瘤的发生发展甚至预后有密切关系。但也有一些研究中肿瘤组织内存在p16蛋白过表达情况，可能是因为被致癌因素刺激其表达所致。

综上所述，p16与皮肤肿瘤的关系密切，但是p16基因在皮肤肿瘤方面的研究仍需继续探索，比如p16基因诊断、基因治疗以及判断预后等方面。