溶瘤病毒治疗肝癌的研究进展

龚涛，琚姝，刘建飞

上海三维生物技术有限公司，上海 201206

肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，其预后差、转移复发率高，患者5 年生存率仅为18%[1-2]。目前针对肝癌的最有效治疗手段为手术治疗，早期肝癌可通过手术切除和消融技术来进行治疗。然而由于肝癌发病机制复杂，临床早期症状不明显，患者就诊时通常已属于中晚期，错过了手术治疗的最佳时机，因此肝癌的临床主要治疗手段通常采用系统联合局部（如介入治疗、放疗等）的综合治疗方案，但由于肝癌对传统的化疗有很高的耐药性，且放疗对肝脏不良反应大，因此寻求有效的肝癌治疗手段显得至关重要[3-4]。近年来，免疫治疗成为继手术、放疗、化疗和靶向治疗之后的一种新型肿瘤治疗方法，其通过引导患者自身免疫系统，激活抗肿瘤免疫反应，阻止肿瘤免疫逃逸，达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的[5]。针对肿瘤治疗的免疫治疗包括免疫检查点抑制剂、过继性细胞免疫治疗、肿瘤疫苗、溶瘤病毒等[6]。随着免疫治疗的迅速发展，溶瘤病毒作为一种新的免疫治疗手段，已显现出较好的治疗效果，成为了肝癌治疗的研究热点之一[7]。本文就溶瘤病毒的作用机制及其在肝癌治疗中的研究进展进行综述。

1 溶瘤病毒的定义及其抗肿瘤作用机制

溶瘤病毒是具有自我增殖能力的一类特异性肿瘤杀伤型病毒，其能够在肿瘤细胞内自我复制并造成肿瘤细胞裂解，同时不影响正常细胞与组织。

溶瘤病毒的作用机制主要有两类：第一类为病毒直接介导的细胞毒作用，溶瘤病毒可特异性感染肿瘤部位并自我增殖，在抑制肿瘤生长的同时扩增大量子代病毒裂解肿瘤细胞，从而直接杀伤肿瘤细胞。第二类为激活免疫系统，通过改变肿瘤微环境，增强肿瘤微环境的免疫原性，或释放肿瘤相关抗原或炎症因子等多种途径，诱导自身免疫系统针对肿瘤细胞进行杀伤，解除肿瘤部位的免疫抑制状态[8-9]。此外，溶瘤病毒也可以感染肿瘤部位血管，破坏肿瘤血管，抑制肿瘤获取营养，从而杀死肿瘤细胞[10]。

2 溶瘤病毒治疗肝癌的研究进展

溶瘤病毒具有直接裂解肿瘤细胞、诱发并增强机体对肿瘤的特异性免疫应答、增强其他抗肿瘤药物效果等多种作用，但不影响正常细胞生长，其特异性强、不良反应小，因此通过基因修饰或改造的溶瘤病毒在肝癌治疗领域备受关注。目前用于肝癌治疗的溶瘤病毒主要有腺病毒、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等[11]。

2.1 溶瘤腺病毒

目前全球已上市两款腺病毒抗肿瘤药物，且有20 多种腺病毒相关药物处于临床试验阶段。腺病毒的主链可进行灵活的基因修饰，由于其高度可定制性，腺病毒成为了最重要的溶瘤病毒之一，在肿瘤治疗中常用的腺病毒为致病力弱的人血清2型或5 型腺病毒[12]。

ONYX-015 是一种5 型腺病毒，删除了E1B-55KD 基因，使其能在抑癌基因p53 缺失细胞中优先复制[13]。在其Ⅱ期临床试验中，19 例肝胆恶性肿瘤患者接受了病灶内ONYX-015 治疗，ONYX-015病灶内注射治疗肝胆肿瘤患者安全且耐受性良好，部分患者有抗肿瘤作用证据。重组人5 型腺病毒H101 与ONYX-015 非常相似[14]，但在其E3 基因中有一个额外的缺失，删除了E1B-55KD 和E3 部分基因片段，使其在精准溶瘤的同时实现全身免疫，是全球首个上市的溶瘤腺病毒抗肿瘤药物。重组人5 型腺病毒H101 可选择性感染p53 功能缺失的肿瘤细胞，而正常细胞不受影响，在一定剂量范围内对p53 功能缺失的肝癌细胞具有抗肿瘤活性。体外研究表明，重组人5 型腺病毒H101 对HepG2细胞有显著抑制增殖作用。在不能切除的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中，经导管动脉栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）联合重组人5 型腺病毒H101 治疗与单独采用TACE 治疗相比，改善了总生存率、无进展生存期和完全缓解率。临床治疗中显示，重组人5 型腺病毒H101 联合TACE 治疗可使肿瘤降期，从而达到手术切除的目的[15]。针对TACE 治疗后部分耐缺氧及化疗耐药的肿瘤细胞，为预防HCC复发，Zhang 等[16]构建了一种缺氧复制型溶瘤腺病毒，克服栓塞后缺氧的肿瘤微环境，可特异性地靶向存活的肝癌细胞。

2.2 HSV

HSV 是嗜神经性的双链DNA 包膜病毒，可分为Ⅰ型HSV（HSV-1）和Ⅱ型HSV（HSV-2）两种血清型。HSV-1 具有宿主范围广泛、能够携带多种外源DNA 等优势，因此目前处于临床试验的溶瘤HSV 大部分由HSV-1 改造而来。

在美国获批的第二代溶瘤HSV-1 T-VEC[17]便是由HSV-1 改造而来的，敲除了c34.5 和a47 基因后将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因插入缺失的c34.5 位点。一项T-VEC 与帕博利珠单抗（pembrolizumab）的Ⅰb/Ⅱ期临床试验目前正在进行中，Ⅰb 期主要研究T-VEC 单药肝内注射治疗HCC 以及T-VEC 与帕博利珠单抗全身静脉给药联合治疗肝转移的安全性，Ⅱ期主要研究T-VEC 与帕博利珠单抗联合给药治疗晚期实体瘤的安全性及有效性（NCT02509507）。第三代溶瘤HSV-1 T-01[18]在第二代溶瘤HSV 的基础上继续改进，删除了病毒蛋白感染细胞多肽6（infected cell polypeptides 6，ICP6），由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）基因取代ICP6 基因，因此也比两个突变的病毒（如T-VEC）更安全。T-01 可抑制人肝癌细胞系和肝母细胞瘤细胞系肿瘤的生长，结果表明第三代溶瘤HSV-1 可作为HCC 患者的新型治疗方法。基于这些进展，设计了一种基于HSV-1 的溶瘤载体Ld0-GFP[19]，该载体来源于溶瘤ICP0 缺失病毒（d0-GFP），具有融合表型，是一种针对HCC 以及其他类型肿瘤细胞的新型杀手。与d0-GFP 相比，Ld0-GFP 在体内外均表现出优越的肿瘤细胞杀伤能力，靶向广谱HCC 细胞，具有更好的安全性。

2.3 溶瘤牛痘病毒

Pexa-Vec（JX-594）是一种具备复制能力、转基因表达的免疫治疗性溶瘤牛痘病毒，可破坏病毒胸苷激酶基因，并表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和β-半乳糖苷酶基因[20]。Ⅰ期临床试验表明，JX-594 治疗原发性或转移性肝癌具有良好的耐受性。在JX-594 复制、粒细胞-巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）表达和全身播散的背景下，其安全性可接受，并对几种难治性肿瘤具有抗肿瘤作用[21]。在随机的Ⅱb 期临床试验中，研究索拉非尼治疗失败后接受JX-594 治疗的疗效和安全性。研究存在显著的局限性，接受JX-594 治疗的患者总生存率没有改善。然而，研究也取得了一些成果，通过β-半乳糖苷酶的测量确认了病毒复制，并通过酶联免疫斑点试验检测了T 细胞对肿瘤特异性抗原[如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、黑色素瘤相关抗原（melanoma antigen gene，MAGE）-A1/A3/A4]生存素的应答[22]。PHOCUS 是一项Ⅲ期临床试验（NCT02562755），对比研究了在既往未接受过全身治疗的晚期HCC 患者中，采用Pexa-Vec 加索拉非尼联合用药和索拉非尼单药治疗的疗效，但在进行中期分析后，结果显示临床试验不太可能达到主要终点，因此终止了该临床试验[23]。

3 溶瘤病毒联合其他治疗手段治疗肝癌的研究进展

尽管一些溶瘤病毒治疗肿瘤的临床前研究得到极大的关注，但在临床试验中，溶瘤病毒的治疗效果往往达不到基于临床前模型的预期疗效，但与其他治疗手段联用时表现出了很强的应用潜力，因此通过其他治疗手段与溶瘤病毒联合使用或许可能是优化其杀伤肿瘤细胞作用的有效策略。

3.1 溶瘤病毒联合化疗药物治疗肝癌

Xiao 等[24]在之前构建的重组腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD（CD55-TMn）的基础上，进一步研究发现CD55-TMn 与多柔比星联合使用可以通过协同作用增强CD55-TMn 在体外和体内的抗肿瘤作用。一项临床研究也显示，对于晚期肝癌患者，在化疗基础上联合H101 瘤内注射可提高客观有效率和生存率，且耐受性良好[25]。

3.2 溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂治疗肝癌

治疗肿瘤的方法之一是使用针对免疫检查点蛋白的抑制剂，如程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）。

王立朋等[26]将PD-1 抗体的重链和轻链插入流感病毒PR8 的聚合酶碱性蛋白1（polymerase basic protein 1，PB1）基因片段和聚合酶酸性蛋白（polymerase acid protein，PA）基因片段中得到重组流感病毒株rFlu-aPD1，体内外实验显示具有良好的靶向杀伤肝癌细胞的效果。在另一项研究中，将CTLA4 插入流感病毒PR8 中得到rFlu-CTLA4，在皮下小鼠肝癌模型中，与注射PR8 病毒相比，瘤内注射rFlu-CTLA4 可抑制肿瘤的生长，延长了小鼠的总生存期[27]。这些结果激发了进一步探索这种溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂的潜在用途。一项关于重组人5 型腺病毒和PD-1 抗体联合治疗的研究结果显示，2 例患者在经射频消融预处理后联合重组人5型腺病毒和PD-1治疗获得了完全缓解，是治疗晚期HCC 的有效方法[28]。一项T-VEC 与帕博利珠单抗的Ⅰb 期临床试验结果也显示，肝内注射T-VEC 联合静脉注射帕博利珠单抗治疗肝癌或肝转移患者是安全可行的[29]，值得进一步研究。

3.3 溶瘤病毒联合靶向药物治疗肝癌

索拉非尼是一种口服多靶点多激酶抑制剂，具有双重抗肿瘤作用，主要用于治疗晚期肝癌以及晚期肾癌，但其单用疗效有限且不良反应发生率高。李璐璐等[30]体外实验研究发现，索拉非尼联合重组人5 型腺病毒注射液H101 对HepG2 细胞的增殖抑制作用明显优于单用索拉非尼，且在一定浓度范围内两药联用表现出协同作用。庄建发等[31]也对索拉非尼联合重组人5 型腺病毒H101 用药进行了研究，结果发现两药联用抑制HepG2 细胞增殖的主要机制为对RAF/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号转导通路起到阻断作用，诱导肿瘤细胞凋亡，并有效抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，抑制肿瘤细胞增殖。VSVΔ51 是水疱性口炎病毒的新型突变体，一项研究发现，具有DNA-PK 抑制能力的小分子药物M3814 可以显著提高VSVΔ51 的溶瘤活性，在外周实体瘤模型中取得了强大的抗肿瘤效果[32]。这种增效作用是通过增强肿瘤细胞的内质网应激实现的，该研究或许可以为肝癌的治疗提供一种新的思路。

3.4 溶瘤病毒协同过继性细胞疗法（adoptive cell therapy，ACT）治疗肝癌

ACT是一种将自体或异体具有免疫活性的细胞在体外进行扩增后再输至患者体内的治疗方法[33]，从而达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK）体外增殖能力强，安全性高，自身具有肿瘤杀伤能力，又不具备抗原呈递能力。溶瘤病毒在治疗实体瘤时采用静脉注射的给药方式往往会导致病毒被免疫系统清除，因此，应用CIK 细胞作为运载溶瘤病毒的载体，可以携带溶瘤病毒，高效感染肿瘤细胞，从而发挥CIK 细胞和病毒的联合杀瘤作用。有研究表明，构建携带抗p21 Ras scFv 的重组溶瘤腺病毒KGHV500，并利用CIK 细胞递送KGHV500，其抗肿瘤疗效远优于单独使用CIK 细胞或KGHV500，开发了一种治疗RAS 驱动的肝癌的新策略[34]。

4 小结及展望

溶瘤病毒具有在肿瘤细胞中选择性复制并裂解肿瘤细胞的独特能力，还能激活自身免疫系统，间接诱导旁观者效应（包括破坏肿瘤血管）并增强肿瘤免疫治疗。近年来，作为一种有潜力的抗肿瘤药物，溶瘤病毒的研究取得了重要进展，但溶瘤病毒的应用仍存在一定的局限性。溶瘤病毒进入机体后易被清除，从而导致靶向肿瘤部位的抑癌病毒量不足，难以发挥出理想的抑癌作用；利用载体装载病毒虽能提高溶瘤病毒的靶向性，但所用载体的安全性及有效性也需进一步研究；同时溶瘤病毒进入机体后，会产生较强的免疫应答，出现诸如发热、流感样症状等常见不良反应。因此，阻碍溶瘤病毒疗法发展的主要因素是肿瘤微环境中的系统和物理屏障。针对溶瘤病毒疗法的上述局限性及不良反应，如下问题亟须进一步研究解决：①降低病毒毒性，提高安全性，确保病毒能够在不感染健康细胞的情况下最大限度地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，尽量减少不良反应。②提高溶瘤病毒靶向肿瘤细胞的能力，构建安全有效的载体平台，防止病毒被人体强大的免疫系统消灭，以提高治疗效果。③溶瘤病毒注射的剂量较大，溶瘤病毒产品目前最大的技术难点在于如何大规模制备以实现批量生产应用。

综上所述，由于溶瘤病毒的独特作用机制，溶瘤病毒在大量的临床前研究中展现出了抗肿瘤的显著疗效及安全性，具有良好的临床应用前景。但是由于肝癌等实体瘤生物学特性更为复杂，临床试验中溶瘤病毒单药治疗肝癌的研究仍未取得突破性进展。溶瘤病毒联合其他治疗手段治疗肝癌具有良好的发展前景，已有临床试验开始对联合治疗手段展开探索，且取得了不错的结果，但目前仍未大范围应用于临床，因此需要更多、更大样本量数据进行验证。