基于全基因组测序的甲型副伤寒沙门菌暴发疫情分离株分子特征研究

李 毅,谢爱蓉,谢中必

甲型副伤寒是由甲型副伤寒沙门菌引起的急性肠道传染病,可通过生活用水、食物、苍蝇、蟑螂接触等传播引起局部暴发或流行,是我国《传染病防治法》中规定报告的乙类传染病之一。该病是全球、特别是发展中国家共同面临的公共卫生问题,而中国副伤寒的发病率和死亡率已明显下降,近50年来,特别是从20世纪90年代至今,发病率基本控制在0.32/10万～1.75/10万,但每年仍有局部流行或小规模暴发[1-4]。该病分布在中国各地,常年散发,以夏秋季多发,发病以学龄及学龄前儿童,青壮年较多,而学校、农村、低洼水网地区是副伤寒的重要流行区,我国南方是主要的流行地区[3-5]。临床上以持续高热,脉搏变缓、食欲减退、腹部不适,部分患者皮肤出现淡红色小斑丘疹(玫瑰疹)、肝脾肿大和白细胞减少等为特征,严重者出现肠出血、肠穿孔、心肌炎等并发症[3,5-6]。2020年12月中旬以来,温州某医院连续报告甲型副伤寒确诊病例,病人均为温州某大学在校学生,因此,温州疾控部门立即组织流调人员到达现场开展流行病学调查与处置,诊断本次暴发疫情系由甲型副伤寒沙门氏菌污染食材引起的食源性疾病暴发事件,随即开展了菌株鉴定、血清型凝集、PFGE分子分型、药物敏感实验和细菌全基因组测序,其分析结果将为暴发病原的确定提供进一步的证据,也有助于进一步认识和分析病原菌的分子特征。

1 材料与方法

1.1 菌株 2020年12月中旬至2021年1月上旬,温州某医院共报告病例18例,均为学生,临床表现以发热(体温≥38.0℃)为主,占100%,头痛占83.33%、腹泻占66.67%,另外有2例出现脾肿大,所有病例的嗜酸性粒细胞均下降,最后从病人血液标本中分离出11株甲型副伤寒沙门菌。

1.2 仪器与试剂 全自动微生物分析系统VITEK 2 Compact和浊度仪为生物梅里埃公司产品;全自动微生物质谱鉴定系统MALDI Biotyper Smart为布鲁克(北京)科技有限公司产品;脉冲场凝胶电泳系 统CHEF MAPPER、Molecular Imager○RGel DocTMXR＋System with Image LabTMSoftware凝胶成像系统为伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品。沙门菌显色培养基购自法国科玛嘉公司;沙门菌血清诱导琼脂与沙门菌血清均为丹麦SSI产品;GN鉴定卡购自生物梅里埃公司;蛋白酶K(20 mg/m L)购自上海生工生物工程有限公司;Seakem Gold Agarose购自瑞士Lonza公司;XbaI内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。Nephelometer比浊仪、加样器、96孔药敏板、CAMHBT肉汤均购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 生化鉴定和血清学分型 首先将菌株接种于沙门菌显色培养基进行初步鉴定,挑取淡紫色菌落接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板,接着进行系统生化鉴定接种GNI鉴定卡和微生物质谱鉴定,然后用沙门菌分型血清作玻片凝集实验,并设生理盐水作为对照[3,6]。血清学分型先用O多价血清玻片凝集,凝集者,再选用单价血清凝集,O抗原确定后,依次用相应的H因子血清凝集第一相和第二相抗原,鉴定结果依据White-Kauffmann-LeMinor抗原表(第9版)[7]血清分型标准,确定血清型别。

1.3.2 甲型副伤寒沙门菌PFGE分析 操作程序可参考伤寒、副伤寒沙门菌的PFGE操作程序或美国CDC沙门菌的PFGE标准操作程序[1]操作,将新鲜菌株悬浊于盛有1 m L细胞悬浊液(CSB),调整细胞悬液浓度至4.0～4.5 McF,将细菌包埋于1%Sea Kem Gold琼脂糖内,用含有25μL蛋白酶K的细胞裂解液(CLB)进行裂解,然后将每个菌株2 mm宽的胶块用XbaⅠ酶37℃酶切3 h,菌株H9812作为分子质量标准。电泳参数:电压梯度6 V/cm,电泳夹角120°,脉冲时间2.16～63.8 s,电泳时间18.3 h,电泳结束后,用GelRed染色并用纯水脱色,然后用凝胶成像仪拍摄图像,并转换成TIFF图像格式。最后运用Bionumerics 7.6软件生物信息学软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析。

1.3.3 全基因组测序及数据分析 全基因组测序委托杭州微数生物科技有限公司。

1.3.3.1 基因组提取、文库构建及全基因组测序 将菌株从菌种保存管划线接种至胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)平板复苏活化,36℃恒温培养箱过夜培养,用无菌接种环刮取新鲜菌落,随后按照天隆细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的全基因组DNA,外送进行测序和文库构建,简要流程如下:电泳检测DNA纯度和完整性后,利用酶切方法将细菌基因组DNA碎片化为200～300 b碱基短片段,使用文库制备试剂盒制备文库,使用Qubit 4.0荧光计和NanoDrop 2000超微量分光光度计进行定量和插入片段大小检测,使用qPCR进行文库浓度定量后在Illumina(因美纳)HiSeqXTen平台开展全基因组测序。

1.3.3.2 下机数据处理 测序得到的原始数据,进行质控(去接头、过滤质量较低的数据),得到clean data,然后通过国家致病菌识别网高性能生物计算数据处理终端中基因分析软件将原始序列进行de novo组装,序列组装拼接以后,通过在相应数据库比对获得毒力基因、耐药基因、MLST、r MLST、cg MLST的数据分析结果。1)MLST、r MLST和cg MLST特征分析 将全基因组序列结果上传网站数 据(http://pubmlst.org/organisms/salmonellaspp)进行线上数据分析,获取每株菌7个管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA)的 等位基因序列号,与沙门菌MLST标准数据库进行比对获得该菌株的序列型别(ST),而同时获取cg MLST的2750个核心基因的等位基因序列号以及r MLST核糖体序列号,然后利用BioNumerics 7.6软件对其进行MLST和cg MLST聚类分析。2)毒力基因和耐药基因分析 利用软件拼接后的序列,通过细菌基因组分析平台fIDBAC(http://fbac.dmicrobe.cn/)提交序列数据获得毒力基因和耐药基因,同时分别参考病原菌毒力因子数据库VFDB(http://www.mgc.ac.cn)和抗性耐药基因数据库CARD(https://card.mcmaster.ca/)。

1.3.4 药物敏感性试验 从新鲜培养的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平皿中挑取3～5个菌落,在去离子水中乳化,并使用比浊仪调节到0.5麦氏浊度。取配制好的菌悬液10μL加入到11 m L CAMHBT肉汤中,得到试验用菌悬液。用加样仪分别在96孔药敏板中每孔加入50μL菌悬液,用粘性封膜密封所有孔,放置36℃恒温培养箱过夜培养后读取试验结果。记录每1种抗生素抑制细菌生长的MIC值。参照美国临床实验室标准委员会(CLSI)标准进行判读,结果为敏感、中介、耐药。大肠埃希菌(ATCC25922)由本实验室保存,其最小抑菌浓度(MIC)值均在标准范围内。

2 结果

2.1 流行病学调查 2020年12月16日下午17时,温州某医院连续报告2例副伤寒病例,均为温州某大学在校学生,疑似有聚集性,温州疾控部门流调人员当天晚上18时55分到达现场开展流行病学调查与处置。根据流调个案表、病例病案及综合讨论,确定病例定义,共搜索到病例18例,其中疑似病例6例,实验室确诊病例12例,均为学生。临床症状和体征:12例确诊病例中,临床表现以发热(体温≥38.0℃)为主,占100%,头痛占83.33%、腹泻占66.67%,另外有2例出现脾肿大,所有病例的嗜酸性粒细胞均下降。流行病学特征:首例病例从发病到确诊间隔28 d,12例确诊病例中,男生3例,女生9例,男女发病比例为1∶3,均为住校大学生,年龄在19至23岁,分布在不同的年级。实验室检测情况:11例确诊病例经温州某医院血培养检测,1例确诊病例经杭州某医院血培养检测,结果均为甲型副伤寒沙门氏菌阳性,而6例疑似病例经血培养检测,结果均为阴性。根据流调情况,所有病例存在可疑外卖7家餐饮店的70份食物及配料、22份环境涂抹标本、33份从业人员血清和肛拭子、3份管网生活末梢水采样检测,结果均为未检出甲型副伤寒沙门菌。温州市疾控中心对温州某医院送检的11例确诊病例菌株进行复核鉴定分析。

2.2 菌株生化鉴定和血清学分型实验 11株菌株经GNI系统生化鉴定和微生物质谱鉴定结果全部为沙门菌。经血清玻片凝集实验,11株沙门菌血清型均为甲型副伤寒沙门菌,血清抗原式为1,2,12:a:-。

2.3 甲型副伤寒沙门菌PFGE分子分型与聚类结果 11株甲型副伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切后带型完全一致,带型相似度100%,具有显著的带型聚集性特征,从分子流行病学角度可诊断为同一传染源导致,具体见图1。

图1 11株甲型副伤寒沙门菌PFGE聚类分析及其分型特征Fig.1 PFGE cluster analysis and typing characteristics of 11 strains of Salmonella paratyphi A

2.4 甲 型 副 伤 寒 沙 门 菌MLST、r MLST和cg MLST分型结果 对11株菌株进行MLST分型鉴定,全部为ST129;cg MLST分型鉴定,全部为cgST-2191;r MLST分型鉴定,全部为3678。从沙门菌数据库下载20株ST129、r MLST 3678完全一样的和3株ST85的英国(UK)病人分离的甲型副伤寒沙门菌细菌全基因组测序数据,通过分析菌株核心基因,与数据库里英国暴发流行的甲型副伤寒沙门菌菌株构建最小生成树,发现11株菌株聚成一簇,提示有共同暴露。虽然同为ST129、r MLST 3678,这些菌株与英国暴发的甲型副伤寒沙门菌菌株亲缘关系还是有差别,同时也说明应用基因组数据的遗传特征分析比传统的MLST方法更为精细和精准。具体见图1和图2。

图2 甲型副伤寒沙门菌cg MLST聚类分析结果Fig.2 cgMLST cluster analysis of Salmonella paratyphi A

2.5 毒力基因分析 通过毒力基因数据库对本次疫情菌株基因组信息进行比对,取Identity≥90,11株甲型副伤寒沙门菌预测获得的基因注释结果均携带21类250种已知毒力基因。其中与染色体上沙门菌毒力岛1(SPI-1)和2(SPI-2)编码的沙门菌侵袭力相关和在胞内存活发挥毒力的2个Ⅲ型分泌系统(typeⅢSecretion/translocation system,T3SS)有关的基因最多有76种;其次是与黏附有关的决定基因有74种,又以I型菌毛有关的基因较多;此外,与沙门菌鞭毛及相关基因有54种,细胞质蛋白有关的基因18种。其他还有与调节、肠菌素铁蛋白利用、伤寒毒素、外膜蛋白、镁离子吸附因子、铁吸收等有关的基因在毒力基因数据库获得注释。详见图3。

图3 甲型副伤寒沙门菌毒力基因分析结果Fig.3 Virulence gene analysis of Salmonella paratyphi A

2.6 耐药基因分析 通过耐药基因数据库对本次疫情菌株基因组信息进行比对,取Identity≥90,发现本次疫情菌株基因组均携带29种耐药基因,具体见表1。

表1 11株甲型副伤寒沙门菌耐药基因携带情况Tab.1 Drug resistance gene carriage of 11 strains of Salmonella paratyphi A

2.7 药物敏感性试验结果 测试结果显示菌株的耐药表型一致。本次11株菌株均表现出对萘啶酸100%耐药,对链霉素100%中介,对氯霉素类(氯霉素)、磺胺类(磺胺异噁唑、复方新诺明)、大环内脂类(阿奇霉素)、喹诺酮类(环丙沙星、左氧沙星、吉米沙星)、青霉素类(氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦)、头孢菌素类(第一代:头孢唑啉;第三代:头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸;第四代:头孢吡肟)、头霉素类(头孢西丁)、单环B内酰胺类(氨曲南、阿莫西林/克拉维酸)、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、链霉素)、碳青霉素稀类(亚胺培南、美罗培南)、多肽类(多粘菌素E、多粘菌素B)、氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星)等28种抗生素均未发现耐药情况。

3 讨论

随着浙江省各地卫生环境的改善及一系列综合防控措施的落实,全省伤寒副伤寒暴发疫情整体呈下降趋势,具有明显季节性特征,以夏秋季为发病高峰[3,8],温州市发病高峰主要发生在冬春季[9],其发病人群一样主要以青壮年和学生为主,农村和学校是重点地区和场所,但仍有散发病例持续存在趋势[3,8]。本次甲型副伤寒沙门菌暴发疫情发生在冬季,发病人群为学生,发生的场所为学校,符合副伤寒沙门菌的流行病学特征,与顾敏华等[10]和唐保晖等[11]报道的一致发生在冬季和学校。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是国际上公认的的细菌分子流行病研究的标准方法,已经成为细菌性传染病实验室调查、溯源分析的“规定动作”,其优势是重复性好分辨力高结果稳定易于标准化[3]。本次暴发疫情通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术快速地进行了11株菌株的溯源调查分析,查找出了各病例间的流行病学关联,发现了聚集性病例,在疫情控制方面发挥了重要作用。但PFGE技术目前在分辨度和识别力方面仍具有一定的技术局限性,不能提供病原菌的遗传进化信息。

随着新一代高通量测序技术的迅速发展和广泛应用,使得从全基因组水平进行疾病监测和暴发疫情处置成为可能,也可为进一步了解本地菌株的病原学特征,与国内外菌株的进化关系及科学防控和临床治疗提供参考。而且,还可以通过基因组序列对暴发的传播来源与途径做出精确的推断,从而在暴发和流行的早期进行控制。因此,通过全基因组测序数据分析,本次暴发疫情11株菌株MLST型、cg MLST型、r MLST型全部一致,说明来源于同一传染源,而选择ST型和r MLST型相同的英国(UK)病人分离的甲型副伤寒沙门菌进行全基因细菌测序数据分析存在遗传差异,主要是MLST基于7个管家基因分析、r MLST型基于核糖体而cg MLST是基于上千个基因位点,将MLST扩展到全基因水平显示了更好的分型能力。相较于仅应用了一小部分基因组信息的多基因位点顺序分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等传统分型方法,基于全基因组的方法能够在暴发溯源研究中更详细地解析传播动态,从而更为精细地分析出致病菌的进化和群体结构。全基因组测序方法显示了极高的分型力、分辨力和可重复性,已经越来越多的应用于病原微生物研究,便于构建公共数据库和网络化应用。

另外,病原菌的一些重要的基因特征,比如耐药基因、毒力基因等也可以通过全基因组测序获得。本研究的11株甲型副伤寒沙门菌分离株基因组通过毒力基因数据库注释,获得了21类250个毒力基因,其中以Ⅲ型分泌系统、黏附、鞭毛等相关基因最为常见。据研究,沙门菌Ⅲ型分泌系统的致病性主要表现在2个方面:一是侵入非吞噬细胞的能力及其在胞内存活的能力,二是在吞噬细胞内复制和增殖的能力,而这些致病能力均与沙门菌毒力岛(SPI)有关,目前已有23个SPI被鉴定出来[12]。SPI编码表达沙门菌绝大多数毒力因子,对沙门菌的致病性起至关重要的作用,而SPI-1与SPI-2在各血清型沙门菌中分布广泛,具有非常重要的功能。T3SS可分泌几种效应蛋白刺激宿主细胞的信号转导途径,引起一系列细胞反应。SPI-1编码与沙门菌侵袭力相关的Ⅲ型分泌系统1(T3SS1),编码的蛋白可以侵入宿主细胞并诱导巨噬细胞凋亡,在沙门菌侵袭巨噬细胞和肠上皮细胞过程中发挥重要作用。目 前,SPI-1上 发 现 含 有inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic等 基 因,与 侵 袭 力 有 关 的Ⅲ型分泌系统成分。本次疫情分离菌株发现编码T3SS1转位蛋白的基因sipA、sipB、sipC、sipD,编码T3SS1效应蛋白的基因sopD、sopE2,编码分子伴侣的基因sicP、invB,编码转录调节因子invA、invE、invF、invH、hilA、orgA、orgB。SPI-2是 由细菌全身致病性相关毒力基因组成的一个基因簇岛,是沙门菌在胞内存活和发挥毒力的重要毒力岛。本次疫情分离菌株在SPI-2上发现编码二元系统的基因(ssrA和ssrB),编码T3SS2结构成分的基因(ssa)如:spiC/ssaB、ssaC、ssaD、ssaE、ssaG、ssaH、ssaI、ssaJ、ssaK、ssaL、ssaM、ssaV、ssaN、ssaO、ssaP、ssaQ、ssaR、ssaS、ssaT、ssaU,编 码T3SS2效应蛋白的基因(sse)如sseA、sseB、sseC、sseD、sseE、sseF、sseG、sseL,编码T3SS2特异性伴侣蛋白的基因(ssc):sscA、sscB。本次疫情菌株与黏附有关的基因有I型菌毛、Peg、Stb、Sef、Sth、Bcf、Tcf、Saf、Std、Ste、Stf、Stk、Csg、Mis L和Sin H等74种菌毛和菌毛操纵子基因,其中沙门菌Ⅰ型菌毛又称Fim菌毛,广泛分布于沙门氏菌属内,本次疫情菌株主要携 带fimA、fimC、fimD、fimF、fimH、fimI、fimY、fimW、fimZ基因,沙门菌Ⅰ型菌毛是菌体表面的一种粘附因子,参与介导细菌粘附多种细胞的过程,是沙门菌定植和侵袭宿主的关键,在沙门菌感染机体的初始阶段起着重要作用。同时沙门菌Ⅰ型菌毛也能促进生物被膜形成,且在天然免疫过程发挥着重要作用,还与鞭毛存在联系,能调节鞭毛基因表达和菌体运动[13-14]。而鞭毛不仅是细菌的运动器官,也是重要的毒力因子,鞭毛所提供的动力可能是细菌入侵细胞的重要因素,鞭毛蛋白可以作为黏附素,有助于细菌在细胞表面的吸附及其后的侵袭与定居。所以,沙门菌在感染过程中,除了I型菌毛,鞭毛和Ⅲ型分泌系统毒力岛多种毒力因子参与沙门菌的致病过程外,其运动、黏附、侵袭和存活时间等还受到多种毒力因子的影响和调控。

通过比对耐药基因数据库,本次疫情11株菌株均含有与氟喹诺酮类(如:萘啶酸)有关的acrA、acrB、acrR、CRP、emrA、emrB、emrR、marA、marR、MdtK、soxS、sdiA和soxR耐药基因,也含有与氨基糖苷类(如:链霉素)有关的acrD、AAC(6′)-Iy、baeR、cpxA和kdpE耐药基因。此外,还均含有其他11种耐药基因,其中bacA、GlpT、PmrF和ugd等4种基因参与沙门菌外排泵作用而介导耐药;gyrA、mdfA、mdsC、mdtB、mdtC和msbA等6种基因参与沙门菌抗生素靶点改变作用而介导耐药;TEM-60基因参与沙门菌抗生素灭活作用而介导耐药。王伟等[15]通过基因组数据分析发现外排泵系统相关的耐药基因可能介导沙门菌多重耐药表型,目前,一般认为acr AB是沙门菌最主要的外排泵,它与四环素、氯霉素等多重耐药性的产生有关。另外,菌株耐药基因情况分析推测,除了现有耐药表型外,已具备对氨基糖苷类和青霉素类抗生素耐药的潜力,因此,临床治疗时应规范抗生素的使用,以免激发新的耐药表型。

本次疫情分离菌株以萘啶酸的单重耐药为主,与温州地区尤荣开等报道的常用抗菌药物的敏感性基本相似[16],与浙江省2008年分离的209株甲型副伤寒沙门菌[17]和曲梅等报道的甲型副伤寒沙门菌对萘啶酸100%耐药[18]一致,而云南省2005－2012年91株甲型副伤寒沙门菌病原学特征分析对萘啶酸也是普遍耐药的[19],该结果提示副伤寒沙门菌可能普遍对萘啶酸耐药,在治疗副伤寒沙门菌时,应特别关注对喹诺酮类药物的耐药问题。同时,本研究结果显示甲型副伤寒沙门菌对氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、链霉素)敏感率大部分都很高,但有学者认为该类药物难以渗入细菌细胞内,尽管体外药敏试验较好也不作为首选药物,并且此类药物不良反应大。而第三、四代氟喹诺酮类药物为DNA旋转酶抑制剂,能阻碍细菌DNA复制合成,从而达到杀菌作用,其具有敏感率高杀菌作用强、毒性低、不良反应少、复发率低,疗效好,价格适中等优点,可作为治疗甲型副伤寒的首选药物,但氟喹诺酮类药物避免用于18岁以下未成年人、孕妇患者,因此应选择第三、四代头孢菌素或头霉素类药物。还有其他类型抗菌药物的临床应用也应该按照研究结果和应用指南进行使用和管理。

通过以上研究内容的分析,提示本次甲型副伤寒沙门菌暴发疫情分析菌株具有同一传染源,将病原体基因组测序和生物信息分析技术应用于传染病监测,是传染病流行病学的最新突破,是疾病防控的新策略和新方法。副伤寒沙门菌感染为一种常见的细菌性疾病,既往报道的暴发疫情大多与水或者食物被污染有关,当食品被被污染后,可因加工过程中加热不彻底或与其他食品交叉污染导致胃肠炎暴发。综合以上分析,推断本次疫情系由甲型副伤寒沙门菌污染食材引起食源性疾病暴发事件,由于客观原因我们在调查过程中始终未能从食物、水体等环境样本中检测出甲型副伤寒沙门菌,本次暴发疫情的调查没有形成完整的病原学证据链,只能推论为由单一传染源引起的散发性暴发,还需要做进一步深入研究和分析。因此,建议:①学校将食源性疾病暴发事件处置方案纳入学校疫情防控应急管理机制,完善监测和报告机制,监测到学校出现疑似食源性疾病暴发事件要按规定第一时间上报;②学校重点加强对校内食堂和餐饮的管理,要保持严格的检查力度和频度,采取有效措施消除老鼠、蟑螂、苍蝇和其他有害昆虫及其孳生条件,确保食堂和餐厅内外环境整洁卫生;③重点教育学生养成良好的个人饮食卫生习惯,牢记“吃熟食、喝开水、勤洗手”的要求。

利益冲突:无

引用本文格式:李毅,谢爱蓉,谢中必.基于全基因组测序的甲型副伤寒沙门菌暴发疫情分离株分子特征研究[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):898-905.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.135