血培养中碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染特征及耐药基因分析

张瀞之,余 琳,张晏栋,刘斯仪,郑晓丹,周贤玲

血流感染(Bloodstream infections,BSI)作为医院内获得感染中严重的感染性疾病之一,主要由于病原菌侵入血流后繁殖并释放毒素从而引发机体出现寒战、高热、肝脾肿大甚至严重者还会出现休克、多脏器衰竭等临床症状[1]。由于近年来侵入性操作的增加和广谱抗生素的滥用,血流感染率高居不下的同时,多重耐药菌和广泛耐药菌的出现也越来越频繁,其病死率高、治疗难度大,已然成为了现今医疗卫生行业的一大挑战。

根据2020年CHINET检测报告显示,在所统计的非发酵革兰阴性杆菌中,鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)的分离率位居第2[2]。而碳青霉烯(Carbapenem)类抗菌药物作为控制不动杆菌严重感染的最有效的药物之一,也被视作为“人类的最后一道防线”。但是由于该类抗菌药物的广泛使用且鲍曼不动杆菌具有对多种抗菌药物天然耐药和获得性耐药的能力,我国鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率已经从2005年的32.9%和41.3%上升至2020年的68.1%和69.0%[3],碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的增多,已然给临床治疗带来了极大的困难[4-7]。

碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制十分复杂,其中产OXA类碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因之一[8-9]。而由于目前并没有CLSI认可的鲍曼不动杆菌适用的碳青霉烯酶产酶实验,且最近有研究报道插入序列ISAba-1的携带可能与OXA型碳青霉烯酶耐药基因的表达水平有关[10-11]。本文旨在通过分析本院2018－2020年临床血培养检出的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的感染特征及了解耐药基因分布情况,探讨鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性与OXA-23等产酶基因的表达水平的关系,进一步明确鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的可能机制,以期为防止院内感染、规范临床抗菌药物的合理使用及为临床早期经验性诊断提供实验室参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源 收集2018年1月至2020年12月广州医科大学附属第一医院临床分离的血培养检出鲍曼不动杆菌共48株,标本的分离培养与鉴定操作依据《全国临床检验操作流程》[12](第四版)进行。剔除同一患者重复分离株,其中敏感菌16株,多重耐药菌(MDRAB)13株,广泛耐药菌(XDRAB)19株,并记录菌株的相关临床信息。

1.1.2 仪器与试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪及配套板卡(法国Bio-Nerieux)、哥伦比亚血平板(安图生物公司/郑州)、电泳琼脂糖(Biowest公司/西班牙)、50x TAE电解质液(Biosharp life sciences公司)、DNA marker DL1000(Takara公司)、TaqDNA预混酶(Takara公司)、PCR仪(美国BIO-RAD公司)、NanoDrop 2000(Thermo Scientific/美国)、电泳仪(百晶生物公司/北京)、紫外凝胶成像及分析系统(Gene Company Limited)、高压灭菌锅(Yamato公司/重庆)、低温离心机(Gene Company Limited)、引物委托(生工)合成。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验 细菌的分离培养按照《全国临床检验操作规程》[12]及《临床微生物血培养操作规范》[13]进行,且48株菌株经VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定和药敏分析,药敏结果参照美国临床和实验室标准中的折点判断耐药性。其中多种耐药菌13株,广泛耐药菌19株,敏感菌16株。多重耐药菌定义为对10类抗菌药物中3类或3类以上药物耐药的鲍曼不动杆菌;广泛耐药菌定义为对10类抗菌药物中8类或8类以上药物耐药的鲍曼不动杆菌。

1.2.2 细菌DNA提取 煮沸法提取细菌DNA,按照NanoDrop2000微量紫外分光光度计中文操作手册检测DNA浓度、纯度并记录。并将DNA作为后续PCR扩增模板保存于－20℃冰箱。

1.2.3 引物序列合成 OXA-23、OXA-51、NDM-1、ISAba-1、IntI参照文献合成引物序列,引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列及产物长度Tab.1 Target gene primer sequences and lengths of products

1.2.4 常见碳青霉烯类耐药基因扩增 PCR反应体系:预混液12.5μL,模板2.0μL,上、下游引物各1.0μL,无菌双蒸水补足体系至25μL。反应条件为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,52℃退火40 s,72℃延 伸50 s,35个循 环;最 后 于72℃延伸10 min,4℃保存。同时以dd H2O代替模板DNA做阴性对照。PCR产物通过浓度为20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。在各耐药基因阳性菌株中分别取1株菌株,将其PCR扩增产物送生物公司进行进一步纯化与基因测序,测序结果在GenBank在线数据库进行序列比对。

1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0统计学软件分析,计量资料采用(±s)表示,计数资料用例数和百分比(%)表示,单因素和多因素分析采用Logistic回归分析。采用PCR技术扩增细菌目的基因,检测结果以阳性、阴性表示基因携带的有无,对敏感菌和耐药菌进行配对χ2检验,检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 血培养分离鲍曼不动杆菌分布特征和药敏结果分析

2.1.1 血流感染的革兰阴性杆菌分布特征 2018年1月至2020年12月广州医科大学附属第一医院血培养分离革兰氏阴性菌共673株。其中鲍曼不动杆菌共48株,占革兰阴性杆菌总株数7.13%,在血培养分离的非发酵革兰阴性杆菌中与铜绿假单胞菌所占百分比相同且并列第一。详见表2。

表2 血流感染的革兰氏阴性菌种类及构成Tab.2 Distribution of characteristics of Gram negative bacteria in patients with bloodstream infections

血培养分离的鲍曼不动杆菌在2018年1月至2020年12月的检出率中,2018年的检出率为7.37%,2020年的检出率为5.63%,2019年的检出率最高,检出率占比8.23%。

2.1.2 血培养分离鲍曼不动杆菌的科室分布情况2018年1月至2020年12月本院临床分离的48株血培养检出鲍曼不动杆菌中,科室分布以重症医学科和内科 为主,分别为19株(39.58%)与17株(35.42%),其次是外科(16.67%)、儿科(6.25%)以及其他(2.08%),急诊和门诊没有检出。48株血培养检出鲍曼不动杆菌中,从重症医学科检出的19株均为耐药菌,其中XDR-AB占68.4%,而内科检出的17株菌中MDR-AB与XDR-AB分别占35.3%与23.5%,外科、儿科也有检出XDR-AB的情况,检出率分别占12.5%与33.3%。详见表3。

表3 不同耐药性鲍曼不动杆菌科室分布情况Tab.3 Distribution of drug resistance phenotypes of A.baumannii among departments

2.1.3 血培养分离鲍曼不动杆菌患者临床特征

2.1.3.1 一般情况 敏感组平均年龄(59±23)岁,男性患者11例(68.75%),平均住院时间(23±17)d,死亡1例(6.25%),好转15例(93.75%),28 d死亡率0例(0.00%),医院死亡0例(0.00%)。耐药组平均(56±19)岁,男性22例(68.75%),女性10例(31.25%),平均住院时间(35±30)d,ICU总数19例(59.38%),ICU住院天数平均(20±31)d,从血液中分离出MDR-AB/XDR-AB后的平均住院天数为(14±13)d,死亡11例(34.38%),好转13例(40.63%),28 d死亡率6例(18.75%)。见表4。

2.1.3.2 基础疾病、实验室相关检查及侵袭性操作情况 敏感组有5例慢性肺部疾病(31.25%),2例肺炎(12.50%),1例糖尿病(6.25%),3例高血压(18.75%),14例恶性肿瘤(87.50%),6例存在手术史(＜30 d)(37.50%);静脉穿刺置管1例(6.25%),输血6例(37.50%),血液透析1例(6.25%),胃管2例(12.50%),支气管镜检查1例(6.25%),气管1例(6.25%),尿 管2例(12.50%)。耐药组有13例(40.63%)从本院不同科室转入ICU继续治疗,其中胸外科3例(9.38%),内科综合科3例(9.38%),呼吸内科6例(18.75%),耳鼻喉外科1例(3.13%);外院转入ICU共6例(18.75%)。耐药组32例患者中有18例有慢性肺部疾病(56.25%),29例肺炎(90.63%),5例糖尿病(15.63%),6例高血压(18.75%),8例恶性肿瘤(25.00%),13例存在手术史(＜30 d)(40.63%);静脉穿刺置管20例(62.50%),输 血22例(68.75%),血 液 透 析2例(6.25%),胃管20例(62.50%),支气管镜检查19例(59.38%),气 管27例(84.38%),尿 管22例(68.75%)。详见表4。

表4 血培养分离鲍曼不动杆菌患者临床特征Tab.4 Clinical characteristics of patients with A.baumannii isolated from blood culture

2.1.3.3 单因素Logistic分析 单因素分析显示:敏感组与耐药组的性别、年龄、住院时长、糖尿病、高血压等因素比较,差异无统计学意义(P＞0.05);而两组的肺炎、恶性肿瘤、静脉穿刺置管、输血、气管插管、尿管插管、胃管插管及支气管镜检查因素的差异具有统计学意义(P＜0.05),除恶性肿瘤感染耐药菌的风险比无恶性肿瘤患者的明显降低以外,具有以上因素比不具有以上因素感染MDRAB/XDRAB的风险更高,其中:有肺炎的患者感染MDRAB/XDRAB的风险是没有肺炎的患者的67.667倍;没有恶性肿瘤的患者感染耐药菌的风险是有恶性肿瘤的21倍;有进行过静脉穿刺置管、输血、气管插管、尿管插管、胃管插管、支气管镜检查的患者感染MDRAB/XDRAB的风险分别是没有实施这些侵入性操作的25.000、3.667、81.000、15.400、11.667、21.923倍。见表5。

表5 患者血流感染鲍曼不动杆菌的单因素Logistic分析Tab.5 Univariate Logistic analysis of A.baumannii blood stream infections in patieuts

2.1.3.4 多因素Logistic分析 将单因素分析差异有统计学意义的变量,进行Logistic多因素回归分析,结果显示混杂因素调整后仅肺炎(OR＝81.894,95%CI:1.519～4415.517)是感染耐药菌的独立危险因素,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.1.4 血培养分离鲍曼不动杆菌对不同抗菌药物的耐药率 结果如图1,在选用的17种抗菌药物中,鲍曼不动杆菌对氨曲南的耐药率为100%;对粘菌素均不耐药(耐药率0%),均为粘菌素中介株或敏感株;对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为66.0%与67.4%。17种药物只有4种药物的耐药率低于50.0%,其余药物呈现不同程度的较高耐药率。

图1 血培养分离的鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率Fig.1 Susceptibility of A.baumannii isolated from blood cultures to antimicrobial agents[n(%)]

2.2 常见耐药基因检测结果

2.2.1 不同耐药性鲍曼不动杆菌常见耐药基因检出情况 在48株血培养分离鲍曼不动杆菌中,耐药基因OXA-23和OXA-51呈现较高检出率,分别为66.7%、81.3%(均＞50%),所有菌株均未检出耐药基因NDM-1。在16株敏感菌中,耐药基因OXA-51的检出率为43.8%,未检出耐药基因OXA-23;而在13株多重耐药菌和19株广泛耐药菌中,耐药基因OXA-23与OXA-51具有较高的检出率,检出率均为100%。部分电泳结果可见图2。

图2 鲍曼不动杆菌耐药基因OXA-23与OXA-51扩增结果Fig.2 PCR results of OXA-23 and OXA-51 in A.baumannii

对比不同耐药性鲍曼不动杆菌耐药基因OXA-23与OXA-51的检出情况(表6),多重耐药菌与广泛耐药菌的OXA-23、OXA-51基因检出率均为100%,且相对敏感菌中没有检出耐药基因OXA-23。耐药基因OXA-23和OXA-51的检出率在敏感菌和耐药菌之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表6 不同耐药性鲍曼不动杆菌OXA-23和OXA-51耐药基因携带情况Tab.6 Gene carriage of OXA-23 and OXA-51 in different drug resistance phenotypes of A.baumannii

2.2.2 不同耐药基因型鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率 无携带OXA-23、OXA-51基因的9株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类、四环素类、氟喹诺酮类药物呈现低耐药,耐药率达到0%;对其他抗菌药物的耐药性各不相同,但大体上均较低,耐药率低过30%。携带OXA-51基因但不携带OXA-23基因的7株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类同样100%敏感(耐药率为0%),除对多肽类药物0%耐药率外,对其他抗菌药物的耐药率均较低。同时携带OXA-51和OXA-23基因的32株鲍曼不动杆菌对所有抗菌药物则大体呈现耐药,其中对碳青霉烯类、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、环丙沙星100%耐药,只对个别药物如多肽类、替加环素抗菌药物呈现低耐药,耐药率在10%以下。可见只有同时携带OXA-51和OXA-23基因的鲍曼不动杆菌才对抗菌药物高耐药,无携带OXA-51和OXA-23基因或只携带OXA-51的鲍曼不动杆菌对抗菌药物则趋向于敏感。见表7。

表7 不同耐药基因型鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率[n(%)]Tab.7 Susceptibility of A.baumannii with different resistance genes to antimicrobial agents[n(%)]

2.2.3 插入序列及整合酶基因检测结果 48株血培养分离鲍曼不动杆菌中,有33株(68.8%)携带ISAba-1基因,其中28株(84.8%)ISAba-1的检出主要集中在MDR-AB与XDR-AB中,而整合酶IntI的整体检出率较低,为18.8%。

通过比对插入序列ISAba-1与整合酶基因IntI在敏感菌与耐药菌中的检出情况,插入序列ISAba-1的检出率在敏感菌和耐药菌之间差异具有统计学意义(P＜0.05),而整合酶基因IntI在2组间差异不具有统计学意义。见表8。

表8 不同耐药性鲍曼不动杆菌ISAba-1和Int I基因携带情况Tab.8 Gene carriage of ISAba-1and Int I in different drug resistance phenotypes of A.baumannii

3 讨论

鲍曼不动杆菌是一种常见的院内感染菌及条件致病菌,常引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎等疾病,其耐药机制复杂,主要包括产碳青霉烯酶、外膜孔蛋白丢失、外排泵过度表达、青霉素结合蛋白发生改变等不同耐药机制[17-18],而对血流感染碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的患者的治疗更是带来了很大的困难[19]。故本研究设计实验探究血培养中碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌不同耐药性的耐药基因检出情况,同时研究不同耐药基因鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率,以便未来可更好地检测和鉴定产碳青霉烯酶介导耐药的鲍曼不动杆菌(CPCRAB),对于抑制和应对CRAB带来的威胁、指导临床经验性用药和院感防控都有着重要的意义。

通过分析发现,2018—2020年从临床血培养分离出的673株革兰阴性杆菌中,鲍曼不动杆菌48株,检出率占7.13%,在非发酵革兰阴性杆菌中检出率与铜绿假单胞菌持平且均为最多,且以2019年检出最多。从科室分布来看,其中大部分菌株(75%)是从重症医学科(39.58%)和内科(35.42%)的患者中分离出来的,这可能是由于本院为一所以呼吸内科为代表的医院,也与肺炎为CRAB独立感染风险因素的分析结果相吻合。其中在所有XDR-AB中重症医学科的检出率最高,占68.4%。血培养分离鲍曼不动杆菌的患者集中在中老年人,且男性多于女性,经治疗后,敏感组的患者绝大部分预后良好,死亡率较低(6.25%);耐药组的患者预后好转与死亡的比例相差不大,死亡率(34.38%)较敏感组高。通过进行单因素Logistic分析,结果显示患有肺炎或接受过静脉穿刺置管、输血、气管插管、尿管、胃管、支气管镜检查等的患者感染耐药菌的风险比对应的没有肺炎或没有以上侵入性操作的要高,而有恶性肿瘤的患者感染耐药菌的风险比没有恶性肿瘤反而要低,这可能是因为有恶性肿瘤的患者感染的绝大部分都是敏感菌,且可能由于大部分恶性肿瘤患者治疗方案为保守治疗,比其他患者接受的侵入性操作少的原因。而两组的性别、年龄、住院时长、糖尿病、高血压等因素比较,差异则无统计学意义(P＞0.05)。对单因素分析差异有统计学意义(P＜0.05)的变量进行多因素Logistic分析,结果显示混杂因素调整后,肺炎(OR＝81.894,95%CI:1.519～4415.517)是感染耐药菌的独立危险因素,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

在耐药率方面,通过分析表7可发现,48株鲍曼不动杆菌中,未携带OXA-23、OXA-51及携带OXA-51但不携带OXA-23的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南两类药物均呈现100%敏感率,而携带了OXA-23的32株菌对该类药物呈现100%的耐药率。提示OXA-23基因可能是造成CRAB耐药的主要原因。

且经统计学分析,耐药基因OXA-23与OXA-51的检出率在敏感菌和耐药菌之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。而不同耐药基因型鲍曼不动杆菌对不同抗菌药物的耐药率也不一样,无携带OXA-23与OXA-51基因或只携带了OXA-51未携带OXA-23基因的鲍曼不动杆菌对各类抗菌药物敏感率普遍较高,其中对碳青霉烯类、四环素类、氟喹诺酮类最敏感;而同时携带OXA-51和OXA-23基因的32株鲍曼不动杆菌对各类抗菌药物则大体呈现耐药,只对个别药物如多肽类、替加环素呈现低耐药率(＜10%)。可见只有同时携带OXA-51和OXA-23基因的鲍曼不动杆菌才对抗菌药物高耐药,无携带OXA-51和OXA-23基因或只携带OXA-51的鲍曼不动杆菌对抗菌药物则趋向于敏感,提示携带有OXA-23耐药基因也可能是造成MDR-AB/XDR-AB出现的重要原因。

同时,对于鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药性与插入序列ISAba1及整合子基因Int-1的关系,我们通过实验与分析发现鲍曼不动杆菌的耐药性与插入序列ISAba1有关;而Ⅰ类整合子IntI的携带率在敏感菌和耐药菌之间的差异则并不具有统计学意义。根据周翠研究团队的结果[20]:OXA-23基因编码的产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌耐药的主要原因,而插入序列ISAba1常伴随OXA-23出现,与我们的结果相符合。而根据戴桂花研究团队的结果显示[16]:MDRAB的耐药性主要与Ⅰ类整合酶的表达有关,而我们通过实验研究发现,血培养中鲍曼不动杆菌的Ⅰ类整合酶IntI基因的携带率在敏感菌和耐药菌之间的差异并不具有统计学意义,这一点则与戴桂花研究团队的结果不一致,主要是由于研究的标本类型不一样,本研究均为血流感染标本,而戴桂花团队研究主要是痰液,渗出液和尿液,只有一个血液感染标本。

综上所述,所有XDR-AB中重症医学科的检出率最高,占68.4%,感染耐药菌的患者死亡率(34.38%)较敏感组高,而肺炎是感染耐药菌的独立危险因素;同时我们研究发现有恶性肿瘤的患者感染耐药菌的风险比没有恶性肿瘤反而要低;我们结果提示携带有OXA-23耐药基因可能是造成血流感染中MDR-AB/XDR-AB碳青霉烯耐药出现的重要原因;鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药性与插入序列ISAba1密切相关,与整合子基因Int-1无关。

利益冲突:无

引用本文格式:张瀞之,余琳,张晏栋,等.血培养中碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染特征及耐药基因分析[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):874-88 2.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.139