超声波衍生化-高效液相色谱法测定水中草甘膦

马 进，张 伟，陈 锷

（甘肃省环境监测中心站，甘肃 兰州 730020）

草甘膦，化学名称为N-（膦酰基甲基）甘氨酸，纯品是白色固体，极性强，是一种有机酸，且不溶于有机溶剂的一种水溶性除草剂[1-3]。草甘膦的内吸传导性和广谱的杀灭效果非常强[4]，世界上许多国家在大量地使用，致使水资源污染，植物损害，威胁到了人类和动物的健康[5-8]，如草甘膦对动物骨髓细胞有明显致突变作用[6]和遗传毒性[7]，对人体的皮肤、呼吸、神经系统等都有影响。因而对草甘膦的检测具有非常重要的意义。草甘膦的检测方法有离子色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等[9-11]。实验中运用柱前超声波衍生化[12]对水中草甘膦进行测定，优化超声波衍生的条件和衍生副产物净化萃取剂的选择，建立了操作较为简单，对前处理仪器要求低，精密度和准确度良好的高效液相色谱法。

1 实验

1.1 仪器和试剂

液相色谱仪，型号1200，配备FLD检测器，Agilent公司；色谱柱：Agilent Eclispe XDB-C18（15μm，150 mm×4.6 μm）；KH-500DE型数控超声波清洗器（昆山禾创）；电子天平（精度0.1 mg）

草甘膦标准溶液（Reagecon公司，Ireland），1000 μg/mL；甲醇、乙腈、二氯甲烷均为色谱纯；十水合四硼酸钠（优级纯，天津光复）；磷酸（优级纯，天津科密欧）；9-芴甲酯氯甲酸酯（优级纯，北京伊诺凯）；滤膜（0.45 μm,聚四氟乙烯，津腾）；二水合柠檬酸三钠（分析纯，天津光复）。

1.2 液相条件

色谱柱：Agilent Eclispe XDB-C18（0.5μm，150×4.6 mm）；

流动相：体积分数为0.2%磷酸溶液，乙腈；

流速：1.0 mL/min；

柱温：30 ℃；

进样量：20 μL；

检测器：FLD，激发波长：254 nm，发射波长：302 nm。

1.3 实验步骤

1.3.1 标准使用液

用100 μL微量进样针准确移取草甘膦标准溶液（1000 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用纯水定容至10 mL刻度，使用液浓度为10 μg/mL。

1.3.2 工作曲线绘制

分别准确移取草甘膦标准使用液（10 μg/mL）5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL到10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻线，其浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L。分别取各浓度点标准溶液2.0 mL于10 mL的聚乙烯塑料管中，加入1.0 mL 9-芴甲酯氯甲酸酯乙腈溶液，0.5 mL四硼酸钠溶液混匀，置于超声波清洗器45 ℃下衍生50 min，加入5.0 mL二氯甲烷超声萃取净化10 min,静止分层，取水相层1.0 mL，过0.45 μm滤膜后上机检测。以草甘膦浓度为横坐标（x），相应的峰面积为纵坐标（y），制作工作曲线。以保留时间定性，外标法定量。

1.3.3 样品测定

量取10 ml水样，加入0.029 3 g二水合柠檬酸三钠，经过预先用甲醇和水活化好的十八烷基硅胶（500 mg/6 ml）固相萃取小柱对样品进行净化，取净化后的样品2.00 mL加入1.0 mL 9-芴甲酯氯甲酸酯乙腈溶液，0.5 mL四硼酸钠溶液混匀，进行超声衍生、萃取净化后取上层水相1.0 mL经0.45 μm滤膜过滤后上机分析。

2 结果与讨论

2.1 草甘膦定性分析

用AgilentEclispeXDB-C18（0.5 μm，150×4.6 mm）色谱柱在荧光检测器下，选择激发波长为230 nm，发射波长为302 nm测定草甘膦，目标化合物响应高，分离度好，见图1。

图1 草甘膦标准色谱图

2.2 草甘膦线性范围和检出限

在上述实验条件下，草甘膦在5～500 μg/L的线性范围内，回归方程为y=0.472 8x+0.508 2，相关系数R=0.999 4，能够满足定量检测要求。工作曲线见图2。

图2 草甘膦标准曲线

当取2.0 mL净化后的空白样品（加标量为10 μg/L），根据上述方法重复测定7次，计算标准偏差S，依据公式MDL=S×t（n-1，0.99）计算检出限，得到检出限为1 μg/L,检出下线为4 μg/L，能够满足生活污水、工业废水、地表水和地下水的检测要求。

2.3 精密度和准确度

取地下水样品，加标浓度为10 μg/L、100 μg/L和500 μg/L的低、中、高三个浓度点，按照上述实验过程，每个浓度点重复测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差。实验数据见表1。

表1 精确度和准确度实验

由表1 可知，加标量在10～500μg/L范围内，回收率为81.8%～96.8%，相对标准偏差为1.91%～3.58%，其准确度高，精密度良好。

2.4 实验条件的优化

2.4.1 温度和衍生化时间

取2.0 mL草甘膦标液，依据上述实验方法进行前处理后，在25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃五种水浴温度条件下，分别用超声衍生30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,用二氯甲烷萃取，过0.45 μm滤膜后上机分析，结果见图3。

图3 衍生温度和时间影响

由图3可知，衍生温度和时间影响草甘膦衍生产物的响应值，低温下，衍生化反应不完全，造成测定时响应过低；高温下，衍生化产物会出现分解现象，使得测定时响应降低；随着衍生反应时间的延长能够看出，衍生化产物的响应值也随时间增大，在50 min时达到峰值，持续延长反应时间，响应值会有所下降。所以，在温度为45 ℃，超声衍生时间为50 min时，草甘膦与9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液发生衍生化的效果最好，响应值最高。

2.4.2 衍生化副产物的净化

当草甘膦与9-芴甲基氯甲酸酯发生反应生成草甘膦衍生物的同时，会产生副产物，在测定时，液相色谱上会出现一个很大的峰，影响草甘膦的测定，所以在测定之前要对水样中的副产物进行净化。

本方法选取三氯甲烷、正己烷和二氯甲烷对衍生过后的样品进行超声萃取净化，通过对比净化效果，可知二氯甲烷的净化效果最好。

3 结论

通过超声波衍生化-高效液相色谱法测定水中草甘膦的实验表明：衍生温度为45 ℃，衍生时间为50 min，衍生产物用二氯甲烷超声萃取净化时，草甘膦的衍生产物分离度好，出峰时间早，衍生副产物去除效果较佳。此外，该方法在草甘膦加标浓度为10～500 μg/L范围内，平均回收率为81.8%～96.8%，相对标准偏差为1.91%～3.58%。本实验精密度和准确度良好，并且操作较为简便，检出限较低，可以满足地下水、地表水、污水、工业废水中草甘膦的检测要求。