中国白内障-小角膜综合征一家系突变基因及表型分析

张达人 卢岚 曾杰 李丹丽 王云 王希振 黄瓅 樊宁 刘旭阳,5

1厦门大学附属厦门眼科中心，厦门 361000；2福建医科大学附属协和医院眼科 福建医科大学眼视光学系，福州 350001；3中国人民解放军联勤保障部队第900医院眼科，福州 350001；4深圳市眼科医院 暨南大学附属深圳眼科医院 深圳市眼病防治研究所，深圳 518000；5深圳市人民医院眼科，深圳 514080

先天性白内障占儿童致盲眼病的10%～38%，其中至少30%由遗传因素引起[1-2]。遗传性白内障常见的遗传方式是常染色体显性遗传，且具有遗传异质性[3]。先天性白内障-小角膜综合征(congenital cataract-microcornea syndrome，CCMC)占常染色体显性遗传先天性白内障的12%～18%[4]。CCMC特征是先天性白内障合并小角膜，而不伴有其他全身疾病或发育异常，其原因可能与晶状体发育不良的继发性损伤或某些生长或转录因子突变相关[5]。迄今为止，已报道100多个基因与先天性白内障有关[5]，其中至少有8个基因同时与角膜发育异常相关，包括编码晶状体蛋白的基因晶状体蛋白α-A(CRYAA，MIM 123580)、晶状体蛋白β-A4(CRYBA4，MIM 123631)、晶状体蛋白β-B1(CRYBB1，MIM 600929)、晶状体蛋白β-B2(CRYBB2，MIM 123620)、晶状体蛋白γ-C(CRYGC，MIM 123680)、晶状体蛋白γ-D(CRYGD，MIM 123690)及α8连接蛋白(GJA8，MIM 600897)、v-maf禽肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物(MAF)[4,6-14]等。本研究对1个4代常染色体显性遗传CCMC家系的临床表型及分子遗传学特点进行分析，确定该家系的致病基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用家系调查研究方法，2019年7月于厦门大学附属厦门眼科中心和福建医科大学附属协和医院眼科收集福建尤溪汉族CCMC一家系，该家系共4代39人，其中患者11例。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，研究方案由厦门大学附属厦门眼科中心医学伦理委员会批准(批文号：XMYKZX-LW-2009-003)，所有受检者均对本研究目的知情并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1病史采集 对家系中能取得联系的成员10人在尤溪县中医院眼科进行基本信息登记，包括姓名、性别、出生日期、与先证者的关系、居住地、联系方式，并对相关成员既往眼部健康状况、全身健康状况、亲属眼部及全身状况进行病史回顾，包括个人史、既往视力、是否有系统性疾病及眼部或全身手术史或外伤史等。先证者及家系中患者的后续检查及复查在厦门大学附属厦门眼科中心、福建医科大学附属协和医院眼科以及尤溪县中医院眼科完成。

1.2.2眼部检查 对家系成员进行详细眼科检查，包括裸眼视力、最佳矫正视力、眼压(SW-500型手持式回弹式眼压计，天津索维电子技术有限公司)、裂隙灯显微镜(SL990N，意大利CSO公司)、彩色眼底照相仪(VISVCAM 524，德国Carl Zeiss公司)、眼部B型超声仪(法国光太公司)、角膜直径测量、眼前节光相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)(SS-1000，日本Tomey公司)、超声生物显微镜(法国光太公司)、角膜内皮镜(SP-1P，日本Topcon公司)及角膜地形图仪(Pentacam AXL，美国Oculus公司)检查等。

1.2.3基因组DNA提取 采集受检者外周静脉血2 ml于EDTA抗凝管。采用QIAGEN DNA抽提试剂盒从200 μl外周血中提取基因组DNA，采用紫外分光光度计进行DNA定量和纯度检测。

图1 常染色体显性遗传CCMC家系图 家系中6例患者(Ⅱ-5、Ⅲ-2、Ⅲ-4、Ⅲ-9、Ⅳ-1、Ⅳ-3)和4名表型正常成员(Ⅲ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-5、Ⅳ-2)纳入研究 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先证者Figure 1 Pedigree of a CCMC family with autosomal dominant inheritance Six patients (Ⅱ-5,Ⅲ-2,Ⅲ-4,Ⅲ-9,Ⅳ-1,Ⅳ-3) and four phenotypically normal members (Ⅲ-1,Ⅲ-3,Ⅲ-5,Ⅳ-2) in the family were included □：normal male；○：normal female；■：male patient；●：female patient；/：deceased；：proband

1.2.4基因突变检测 采用北京迈基诺医学检验所开发的晶状体异常基因检测芯片panel-V3(含与晶状体异常发育相关的188个已知致病基因)对先证者进行基因筛查。基于二代测序技术对目标区域基因进行捕获及高通量测序，平均每个样本测序深度达300×。具体步骤：提取1～5 μg DNA，利用酶切的方法进行片段化，末端修复，3'末端加“A”，再加接头得到350～400 bp的片段，采用该公司自主研发的液相捕获试剂盒，按照标准流程进行杂交、洗脱、文库扩增。采用illlumina NextSeq 500测序仪进行高通量测序。对测序数据进行分析滤过，筛选条件为：(1)错义、剪切、无义、同义、启动子以及通读突变；(2)1000 genome、dbSNP和HapMap数据库中频率小于0.01的突变；(3)纯合子大于10及杂合子相加大于10的突变。采用Sanger测序检测其他家系成员是否携带筛检出的可疑致病基因及突变，以确定是否与疾病表型共分离。

1.2.5生物信息学分析及变异致病性分析 通过dbSNP数据库检索变异位点在正常人群中的等位基因频率；采用蛋白功能预测软件REVEL对变异位点进行生物信息学分析，评估致病性。采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白保守结构域。采用ProtParam工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)对突变蛋白质物理化学性质进行分析。通过PolyPhen-2在线软件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)预测变异对蛋白功能的影响。通过NCBI网站对变异位点进行同源性分析，比较其在不同物种中的保守性。

2 结果

2.1 临床表现分析

该家系符合常染色体显性遗传(图1)。先证者，女，16岁，自幼视力差，曾于厦门大学附属厦门眼科中心诊断为双眼先天性白内障。于2005年先后行双眼白内障超声乳化摘出联合人工晶状体植入术；2017年，因右眼孔源性视网膜脱离行右眼巩膜外加压术。双眼角膜直径9 mm，眼轴长度右眼22.22 mm，左眼20.73 mm，诊断为CCMC。该CCMC家系39名成员中有11例CCMC患者，均自幼视力差，有小角膜和晶状体混浊表型(图2)，角膜直径为7～9 mm，其他眼部检查及全身系统性检查未见明显异常。该家系部分成员临床表型见表1。

2.2 分子遗传学分析

通过靶向高通量测序发现先证者CRYAA基因杂合变异c.61C>T，经Sanger测序验证，该位点在所有患者中均存在，而在正常表型家系成员中均未发现，符合基因变异与临床表型共分离(图3)。dbSNP数据库检索显示该变异位点在正常人群中的等位基因频率极低(A<0.000 01)，InterPro分析发现该变异点位于CRYAA基因保守区，引起第21位氨基酸由精氨酸(Arg)变异为色氨酸(Trp)。ProtParam分析显示变异蛋白产物阳离子基团(Arg+Lys)总数减少，且亲水性(Grand average of hydropathicity:-0.469)及稳定性下降[The instability index (Ⅱ):51.54]。PolyPhen-2在线软件预测CRYAA基因的R21W变异可能损害蛋白功能，分值为1.000。同源性分析结果显示，该位点在猴、犬、牛、鼠等多个物种中均高度保守。

图2 患者Ⅲ-9眼前节照相 可见晶状体全混浊Figure 2 Anterior segment photo of patient Ⅲ-9 Lens opacity was obseved

表1 该家系部分成员眼部临床表型Table 1 Clinical phenotypes in some family members成员年龄(岁)性别UCVA(BCVA)角膜直径(mm)右眼左眼右眼左眼是否患白内障Ⅱ-563女0.080.17.08.0是Ⅲ-153男1.01.011.011.0否Ⅲ-245女0.2(0.4)0.4(0.6)9.09.0是Ⅲ-343男1.51.512.012.0否Ⅲ-443女0.15(0.4)0.6(0.5)8.08.0是Ⅲ-539男1.21.211.511.5否Ⅲ-932男0.250.38.58.5是Ⅳ-124女0.4(0.6)0.04(0.06)8.58.5是Ⅳ-219男0.60.812.012.0否Ⅳ-316女0.15(0.25)0.2(0.6)9.09.0是 注:UCVA:裸眼视力;BCVA:最佳矫正视力 Note:UCVA:uncorrected visual acuity;BCVA:best corrected visual acuity

图3 该CCMC家系CRYAA基因变异Sanger测序验证 CCMC患者存在CRYAA基因杂合变异c.61C>T，而在正常表型家系成员中均未检测到此变异，箭头所示为变异位点 A：突变型 B：野生型Figure 3 Verification of CRYAA gene variant in the CCMC family by Sanger sequencing A heterozygous variant c.61C>T in CRYAA gene was found in the patients,which was not found in the phenotypically normal members.Arrows indicated the variant A：mutant type B：wild type

3 讨论

CCMC临床表现为角膜直径小于11 mm及伴有遗传性白内障，其他罕见眼部表现包括近视、虹膜缺损和Peters异常等[15-16]。按照晶状体混浊形态，CCMC患者白内障可分为星型、皮质型、核型和混合型[4]。本研究在福建尤溪地区发现1个CCMC家系，该家系中患者均自幼视力差，所有患者角膜直径均未超过9 mm，未手术者白内障为混合型；未患病成员角膜直径正常。

目前已报道的与先天性白内障有关的基因中约1/2为晶状体蛋白基因，1/4属于膜蛋白基因[16-17]。晶状体蛋白是组成晶状体的主要蛋白质，90%为水溶性蛋白，在维持晶状体透明性以及屈光方面发挥主要作用[18]。晶状体蛋白基因变异可能会影响蛋白质的稳定性、溶解性和寡聚特性，干扰晶状体蛋白的有序排列，使晶状体混浊[19]。根据溶解度差异，水溶性晶状体蛋白可以分为α、β、γ 3种亚类，其中α晶状体蛋白属于具有分子伴侣功能的小分子热休克蛋白家族，通过模拟分子伴侣作用，使变性的晶状体蛋白保持可溶性，维持晶状体的透明性，在防止细胞凋亡和保留细胞骨架完整性方面也具有重要作用[20]。

本研究证实该CCMC家系的发病原因为CRYAA基因杂合变异c.61C>T，其表达产物αA-晶状体蛋白N端区域的第21位氨基酸精氨酸(R)被色氨酸(W)取代。既往亦有研究报道该CRYAA变异与CCMC相关[4,21-22]，其中Devi等[22]发现，CRYAA基因上的多个变异位点导致的先天性白内障均合并有小角膜表型，这些变异主要位于N端及ACD区域的小热休克蛋白保守区。本研究中CRYAA基因变异位点主要位于N端及α晶状体蛋白结构域区间，推测可能与该区域序列保守性更强，变异后对α晶状体蛋白模拟伴侣作用影响更大有关[23]。同时不同点突变产物的生物信息学分析提示N端及ACD区域氨基酸改变导致蛋白产物阳离子基团总数减少，且亲水性及稳定性下降，从而导致白内障的发生。

CRYAA基因除p.R21W变异可引起小角膜外，另有4个位点变异导致CCMC(表2)，严重者合并有小眼球[24]。这些变异均与CCMC相关，但引起白内障的表型并不完全相同。

表2 CCMC家系致病基因及临床表型Table 2 Pathogenic genes and the clinical phenotypes of the CCMC family序列改变氨基酸改变眼部表型C413TR116C核性白内障,小角膜[6,25-27]G347AR116H星型白内障,小角膜[4,6-7,26-28]C34TR12C核性白内障,眼轴轴向伸长,小角膜[4,22]C160TR54C常染色体隐性遗传白内障,小角膜[29]常染色体显性遗传白内障,小角膜[22]C61TR21W白内障,小角膜[4,21-22] 注:CCMC:先天性白内障-小角膜综合征 Note:CCMC:congenital cataract-microcornea syndrome

目前对于先天性白内障合并小角膜的机制尚不明确，相关假说根据其机制可分为2类：(1)转录因子或生长因子相关突变，这类突变累及的基因对维持和促进晶状体及眼前节结构发育具有重要作用，突变后的基因可表现为多效性[30]；(2)突变基因除了诱导调控胚胎时期晶状体，对其他眼前段组织的细胞分化也具有多级诱导作用。晶状体发育异常可间接导致包括小角膜在内的眼前段异常。对于部分基因突变存在小角膜及小眼球2种不同表型，推测两者可能属于同一范畴的临床表型，但是其严重程度存在区别，可能与晶状体异常导致的眼球发育诱导调控障碍有关；这也与本家系中同时存在小角膜及小眼球2种临床表型相符。亦有研究者推测可能是由于妊娠第5个月后角膜发育停滞所引起，但目前CRYAA基因突变与眼前段发育异常的机制尚未见相关实验研究报道。因此，进一步研究这些表型、了解不同基因的功能，分析其在晶状体发育过程中的作用及其与眼前段结构的关系，有望阐明突变基因在CCMC发病机制中的作用。

本研究CCMC家系的致病变异位点为CRYAA基因杂合变异c.61C>T(p.R21W)，为国内首次报道。小角膜可能与晶状体发育异常引起的诱导调控障碍有关。本研究丰富了CRYAA基因在白内障以及眼球发育过程中作用的认识，进一步的动物实验有助于阐明其发病机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明张达人、卢岚：参与选题、酝酿和设计试验、论文撰写及修改；曾杰：参与实施研究、采集数据；李丹丽、王云、王希振、樊宁：分析/解释数据、对文章知识性内容的审阅；黄瓅：参与论文撰写及修改；刘旭阳：参与论文选题、酝酿和设计试验、论文定稿