PTEN靶点检测在高miR-182-5p表达乳腺癌中的临床应用

赵月生，陶昆麟，李祖彬

(齐齐哈尔医学院附属第三医院乳腺外科，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

乳腺癌是女性发病率居首位的恶性肿瘤，该疾病是在乳腺上皮细胞等多种致癌因子共同作用下形成的，早期以乳房肿块、乳头溢液以及腋窝淋巴结肿大等为主要症状，晚期可发生远处转移，对患者生命安全造成直接影响[1-2]。相关研究[3]表明，乳腺癌经系统治疗后，五年生存率较为可观。但是也有研究[4]报道，复发率、侵袭性、远处转移仍是影响患者5年生存率的主要危险因素，故对乳腺癌转移的研究成为临床亟待解决的问题。微小RNA(miRNA)是一类单链小分子RNA，可以与靶RNA进行配对，miRNA-182-5p为癌基因的表达产物，在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中表达增加[5]。另外miR-182-5p通过下调胃癌患者癌细胞的RAB27A来增强细胞的活力、有丝分裂、迁移和侵袭[6]；在肝细胞癌中，miR-182-5p可激活Wnt/β-catenin信号通路信号，对FOXO3a进行抑制，从而达到抑制β-联蛋白退化，提高与β-联蛋白之间的交互作用。此结果提示miR-182-5p可通过多种方式作用于癌细胞的增殖、转移以及分化过程中，因此对miR-182-5p的研究可能对癌细胞的转移提供思路。染色体丢失的磷酸酶基因(PTEN)是一个抑癌基因，可特异性地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)去磷酸化，拮抗PI3K/Akt信号传导通路，从而发挥抑制肿瘤细胞的作用[7]。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2018年3月～2021年3月于齐齐哈尔医学院附属第三医院接受手术治疗的106例乳腺癌患者病例组。①纳入标准:符合乳腺癌的诊断标准[8]；临床资料完整；术前未接受放疗、化疗、免疫治疗等其他抗肿瘤治疗。②排除标准：合并其他恶性肿瘤的患者；行乳腺假体植入；依从性差者。年龄38～65岁，平均(51.36±13.01)岁；体重指数(BMI)18～24 kg/m2，平均(20.12±1.67)kg/m2；TNM分期：Ⅰ期：49例，Ⅱ期37例，Ⅲ期12例；Ⅳ期8例；分化程度：低分化68例，中分化24例；高分化14例；肿瘤直径：<2 cm 86例，≥2 cm 20例。纳入同期进行健康体检的97例健康人群为对照组。①纳入标准：既往无放化疗或免疫治疗史者；临床资料完整者。②排除标准：合并其他恶性肿瘤者；行乳腺假体植入；依从性差者。年龄37～64岁，平均(50.96±12.98)岁；BMI 18～25 kg/m2，平均(20.52±1.92)kg/m2。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2研究方案：对两组进行miR-182-5p及PTEN靶点检测。分析两组一般资料、PTEN及miR-182-5p的表达水平。根据miR-182-5p表达水平的高低分为低表达组和高表达组，分析两组患者一般资料以及PTEN在两组患者中的表法水平。

1.3方法：将患者的石蜡标本和对照组人群乳腺组织作为标本并进行预处理。将冻存的乳腺细胞株复苏后进行培养，将其接种于远孔板中，待细胞丰度达到90%时终止培养，并运用PBS冲洗2次，然后加入miRNA提取试剂盒中裂解液，收集细胞并放于-80℃的冰箱中备用。取约200 mg的乳腺组织并置于液氮中进行固化、研碎和加入miRNA提取试剂盒中裂解液，作为备用。使用miRNA提取试剂盒直接提取miRNA，用分光光度计(NanoDrop，Wilmington，DE，USA)检测miRNA的质量以及浓度。反转录后，加入反转录试剂合成互补的miRNA。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织或细胞中分离总RNA。按照扩增说明，用荧光定量(PCR)仪器进行扩增。扩增完成后分析miR-182-5p或PTEN的表达。

1.4统计学方法：采用SPSS22.0软件进行t检验，χ2检验、秩和检验。

2 结果

2.1随访结果：对病例组106例患者进行为期1年的随访发现，共计有86例患者生存，总生存率为81.13%。

2.2两组miR-182-5p和PTEN比较：病例组miR-182-5p表达水平高于对照组，PTEN低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组miR-182-5p和PTEN比较

2.3高miR-182-5p表达组和低miR-182-5p表达组一般资料及PTEN比较：两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，高表达组病理分期较低表达组差，PTEN较低表达组低(P<0.05)。见表2。

表2 高低miR-182-5p表达组一般资料及PTEN比较[n(%)]

2.4高miR-182-5p表达组和低miR-182-5p表达组生存率比较：对所有患者进行为期1年的随访发现，高表达组患者生存率65.22%(45/69)低于低表达组83.78%(31/37)，差异有统计学意义(χ2=4.091P=0.043)。

3 讨论

乳腺癌由于早期缺乏特异性临床症状，故该疾病在临床确诊时多为晚期，对于晚期患者而言由于其错过放化疗的最佳时间，乳腺癌根治术为其首选治疗方式。但是乳腺癌根治术后约有10%～30%的患者出现转移，从而导致癌症复发，增加死亡率[9]。近年来分子生物学的研究不仅使研究者对乳腺癌术后发生转移病理生理学的理解，也对乳腺癌转移相关分子机制进行全面概述，有助于找到潜在的预测性生物标志物和药物靶点，以预防和治疗肿瘤细胞的转移。miRNA是一种具有基因调节功能的非编码RNA，其可通过与靶mRNA的3′-非翻译区结合起作用[10]，且因其具有显著的组织特异性，故已被用于识别原发性癌症组织。miR-182-5p可保护胃癌细胞中的细胞活力、迁移和侵袭。但是其在乳腺癌中的作用及其机制还不完全清楚。近年来相关研究[11]发现，miRNA可调节各种癌症的靶向基因表达，因此通过对癌症基因靶点的研究或许可对miR-182-5p在乳腺癌的发病机制中的作用进行阐述。PTEN被认为是一种肿瘤抑制因子，在多种癌症中受损，其通过调节不同癌症的代谢和生长，导致不同的生物学结果。

miRNA以癌基因或抑癌基因的角色在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，并且参与恶性肿瘤分化、增殖、代谢、凋亡的全部生理过程，在癌症发生发发展过程中扮演重要角色[12-13]。当期人体内有30多种miRNA，其在肿瘤细胞的表达中有上调的也有下降的。miR-182-5p是一种miRNA，其在miR-182-5p在肝癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌等癌症中呈上升趋势[14]，另外有研究[15]发现，miR-182-5p在三阴性乳腺癌患者中通过下调MTSSl水平而加快癌症的转移，且癌症转移速度同miR-182-5p表达水平呈正相关。本研究说明miR-182-5p在乳腺癌患者中也呈上升趋势，此结果同陈智凯等人的研究[13]结果一致。当前大量的研究[16-17]均已证实PTEN与细胞增殖呈负相关，PTEN基因突变或缺失可导致细胞过度增殖，从而加速肿瘤细胞的转移。且现有的研究[18]结果显示，在恶性胶质瘤、原发性乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌等大量的肿瘤成分中证实了PTEN的缺失和突变。本研究说明PTEN可对癌症因子进行抑制。PTEN是人类截至目前发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其通过脂质磷酸酶活性使细胞内第二信使3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，诱导CDK抑制剂P27活性，使细胞周期阻滞在G1期而发挥其抑癌作用[19]。另外PTEN的末端区域的175个氨基酸序列与细胞骨架中的张力蛋白具有同源性，因此可共同参与细胞生长的调节，在PTEN具有抑制细胞周期进展、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移、铺展和局部黏附等多种生理功能[20]。

杨悦等的研究[21]中通过对上调miRNA-137在肿瘤细胞发生发展的具体机制进行研究，发现了miRNA-137通过抑制PTEN，而调节PI3K/AKT信号通路，从而发挥抑癌作用，表明miRNA-137可通过调节PTEN而在乳腺癌的发生发展过程中起作用，说明miRNA同PTEN具有关联。赵兴亮等人在其研究[22]中发现，在前列腺癌中过表达miR-182-5p，SMAD4蛋白表达下降、PC-3细胞增殖能力增强，抑制miR-182-5p表达后，SMAD4蛋白表达升高、PC-3细胞增殖能力下降，由此可见miR-182-5p表达水平对癌细胞的增殖、分化起着重要的作用，并且miR-182-5p表达水平越高，SMAD4蛋白表达越低，癌症进展越为明显，其结果表明miR-182-5p的表达水平和癌症的发展紧密相关。本研究中高表达组病理分期较低表达组差，并且miR-182-5p表达水平和病理分期密切相关。其原因为：高表达的miR-182-5p可降低机体抵抗击癌细胞增殖和侵袭的能力，进一步通过调节miR-182-5p耗竭对细胞增殖和侵袭有保护作用。另外高表达组PTEN较低表达组低，表明miR-182-5p通过抑制PTEN而参与癌症的生理过程。PTEN是一种脂质磷酸酶，且有研究[23]表明，PTEN是miR-182-5p的一个作用靶点，通过拮抗PI3K/AKT通路的活性而抑制肿瘤的发生和发展。而在一项动物实验中发现，miR-182-5p的缺失通过上调PTEN表达抑制肿瘤生长，再次表明miR-182-5p和PTEN的表达水平呈负相关，PTEN通过拮抗miR-182-5p而发挥抑癌作用。另外对患者进行为期1年的随访表明miR-182-5p可对患者的生存期限进行影响。

综上所述，miR-182-5p和PTEN在乳腺癌患者中呈异常表达，PTEN可以对miR-182-5p的表达进行抑制。