肿瘤干细胞在肿瘤转移中的机制

郑丽萍,郑彩燕

(1.福建省儿童医院药剂科,福建 福州 350014;2.福建省立医院药剂科,福建 福州 350013)

在过去的几十年里，癌症的治疗方法取得了很大的进步。然而，据报道单就美国2022年将有191万余例各类癌症新发病例和60.9万余例死亡病例[1]。其中，皮肤黑色素瘤将导致99 780例新发病例和7 650例死亡病例。尽管在癌症治疗方面取得了很大进展，但是由于转移灶通常对手术治疗、放化疗以及其他治疗方式具有抗性，导致肿瘤转移成为实体恶性肿瘤患者死亡的首要原因[2]。就黑色素瘤而言，它可以从局部皮肤疾病迅速发展为区域淋巴结转移以及更严重的内脏转移。据报道，如果黑色素瘤患者在肿瘤发生转移之前就被诊断出来，这些病例的5年生存率可达99%。然而，与之形成鲜明对比的是，一旦发生了转移，这些患者的5年生存率急剧下降到只有12%～15%[3]。血源性转移是肿瘤转移的主要方式，主要包括肿瘤在原发部位生长、血管化、侵入血管、循环、附着于毛细血管床、外渗和远端生长等复杂的连续步骤组成的转移级联[4]。

虽然肿瘤的转移是可怕的，但从另一方面来看，肿瘤转移的效率也是很低的。具体来说，在肿瘤转移过程中，数以百万计的肿瘤细胞逃离原发肿瘤进入循环系统，但由此形成的转移灶数量远少于弥散的肿瘤细胞[5]。不仅如此，研究显示肿瘤患者外周血中能够检测的循环肿瘤细胞极其罕见[6]。也有证据表明，肿瘤的生长、繁殖和转移仅依赖于肿瘤实体中的一小部分细胞。这一概念最初是基于这一现象得出的，即在体内外实验中测定多种类型的肿瘤细胞的增殖潜力时，只有少数细胞显示出突出的增殖能力[7]。也有研究把上述的细胞子集认定为肿瘤干细胞[8]。

同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)是一种可靠的蛋白质组学定量技术，近年来引起了人们的极大关注。在癌症研究中，iTRAQ是一种广泛应用的技术，常用于筛选疾病进展和化疗反应的生物标志物。通过运用iTRAQ蛋白质组学技术，Liu等人发现了一组新的胰腺癌生物标志物，包括载脂蛋白E (APOE)、α-胰蛋白酶抑制剂重链H3(ITIH3)、载脂蛋白A1(APOA1)、载脂蛋白L1(APOL1)。这与单独使用CA19-9作为标志物相比，显著提高了胰腺癌诊断的敏感性和特异性[9]。Zhao等人通过蛋白质组学技术发现多西紫杉醇敏感的PC3细胞和多西紫杉醇耐药的PC3-Rx细胞之间的蛋白质组学间也存在差异，并在临床患者中验证了这种显著变化[10]。

本研究利用肿瘤转移动物模型，在亲本鼠源黑色素瘤细胞株(B16F10)的基础上，建立了肺转移性黑色素瘤细胞株(B16F10M)，并利用iTRAQ蛋白质组学技术，发现与亲本黑色素瘤细胞相比，转移性黑色素瘤细胞发生了代谢重组。具体来说，转移性黑色素瘤细胞的糖酵解水平发生了下调。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1 材料与方法

1.1试剂和耗材：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(万类生物)、RT-qPCR引物(生工生物科技)、三氟乙酸、碘乙酰胺和二硫苏糖醇(Sigma Aldrich)、iTRAQ试剂盒(AB Sciex)、测序级改良胰蛋白酶(Promega)。

1.2细胞：鼠源B16F10黑色素瘤细胞株和人黑色素瘤细胞株A375购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。将eGFP-N1质粒转染B16F10细胞，获得带绿色荧光标记的B16F10-GFP细胞。分别从C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠肺转移瘤中分离出其子代B16F10M-GFP和A375M细胞株。主要过程包括：将亲代细胞静脉注射到小鼠体内，1个月后剥离肺转移灶。使用胰蛋白酶(0.1%)和胶原酶Ⅰ(0.1%)混合酶解组织片段。最后，细胞在完全培养基中培养。B16F10、B16F10M、A375和A375M黑色素瘤细胞均培养于含10% (v/v)胎牛血清(Gembio)、1%青霉素/链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养基(Hyclone)中，培养箱湿度控制为37℃，CO2浓度控制为5%。

1.3ATP含量检测:本研究采用ATP检测试剂盒测定ATP含量。简单来说，在细胞悬液中加入100 μl ATP检测试剂，充分混匀3 min，随后转移到96孔板上，黑暗中静置10 min。最后，使用酶标仪检测荧光强度。根据相对荧光强度(荧光/细胞数)来定量ATP含量。

1.4iTRAQ:本研究采用蛋白质组学iTRAQ技术研究B16F10细胞和B16F10M细胞的蛋白表达差异，蛋白提取、质谱、蛋白解析、数据分析外送杭州景杰科技生物有限公司开展。

1.5生物信息学分析:本研究分别检测3个B16F10和B16F10M细胞样本，对3个重复样本质谱数据的平均值进行进一步分析。如果B16F10M与B16F10的绝对平均比率>1.5或<0.67，且P<0.05，则将该蛋白视为差异表达蛋白。 利用UniProt-GOA数据库和KEGG数据库对蛋白质注释、功能分类、功能富集和聚类分析进行生物信息学分析。利用在线STRING数据库和Cytoscape软件生成蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，富集PPI子网络。

1.6RT-qPCR:使用TRIzol试剂盒提取RNA，将收集到的RNA用15～20 μl DEPC水溶解后，使用Q5000超微量紫外可见分光光度仪测定其浓度和纯度。使用PrimeScript®RT reagent Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，反转录结束后使用紫外可见分光光度仪测定cDNA浓度。使用SYBR®Premix Ex TaqTM PCR Kit试剂盒进行实时定量PCR反应，反应结束后，使用SDS-PAGE电泳验证扩增的产物是否与理论的扩增产物一致。最后，通过2-ΔΔCt法计算各基因相对于内参基因(ACTB)的表达量。

1.7凋亡检测:本研究采用流式细胞术分析细胞凋亡情况。简要如下：将肿瘤细胞以3×105个/孔培养于6孔板中，用完全培养基培养数天，后置于氧气浓度为1%的低氧工作站36 h，收集上清和细胞，离心、洗涤、重悬。使用5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混合染色，4℃避光孵育15 min后，使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.8动物实验:动物实验按照国家自然科学基金委关于实验动物关爱使用的相关规定进行操作。对所有动物进行异常行为监测，以减少动物的疼痛和痛苦。如果发现动物健康状况严重恶化，则对动物实施安乐死。

2 结果

2.1B16F10M的构建:基于B16F10，成功构建了B16F10M。见图1。图1中箭头所示的黑色结节就是亲代B16F10在小鼠肺部形成的转移灶。通过体外细胞培养和荧光显微拍照证实了图示的黑色结节起源于亲本B16F10细胞，而不是来自宿主小鼠。

图1 B16F10M细胞株的构建

2.2B16F10M糖酵解相关蛋白表达水平的下调:通过运用iTRAQ蛋白质组学技术，对亲本B16F10细胞和肺转移B16F10M细胞纯化的蛋白提取物进行分析，揭示两个细胞株蛋白表达谱的差异。通过对蛋白质组学结果的分析，共鉴定出了3 348个蛋白，并对其中的2 467个蛋白进行了定量分析。 通过将两株细胞中蛋白质表达水平差异高于1.5倍或者低于0.67倍的蛋白视为差异表达蛋白(B16F10M/B16F10，P<0.05)，发现相比于B16F10细胞，有 147个蛋白在B16F10M细胞中呈现出表达上调，175个蛋白呈现出表达下调。

将蛋白质组学鉴定出的差异表达蛋白从生物过程、细胞成分、分子功能三个方面进行聚类分析。见图2。从分子功能层面，发现在上调表达的蛋白中，52%的蛋白为连接蛋白，25%的蛋白具有催化活性；在下调表达的蛋白中，这两种蛋白的比率分别为48%和37%。

图2 差异表达蛋白的GO分类分析

对差异表达蛋白进行KEGG富集分析，结果见表1。共富集出24个通路(P<0.05)，主要包括补体系统和凝血级联、碳代谢、磷酸戊糖途径和糖酵解/糖异生代谢通路等。

表1 差异表达蛋白的细胞信号通路分析

通过利用在线数据库STRING和Cytoscape软件，分析这些差异表达蛋白的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。得到了与前面相似的结果，发现差异表达蛋白中最显著变化的5个信号通路是糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成、碳代谢、氨基酸的生物合成和代谢通路。这两种方法均表明糖酵解/糖异生代谢途径在肿瘤转移过程中发生了显著的下调。对两个细胞株细胞内ATP产量进行检测，也发现B16F10M细胞胞内ATP产量低于B16F10细胞，验证了两株细胞代谢上的差异。见图3。进一步研究发现涉及糖酵解/糖异生相关蛋白包括PKM、ALDOA、LDHB、TPI1、LDHA、人肝脏磷酸果糖激酶(PFKL)、PGAM1、肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)、PGK1、GPI1和ENO1。见图3。

图3 B16F10M细胞糖酵解水平下调

2.3RT-qPCR验证蛋白质组学结果:通过前面对差异表达蛋白进行分析，许多下调表达的蛋白参与了糖酵解/糖异生过程。为了验证这一结果，本研究通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对这一结果进行验证，除LDHA外，其他基因的转录水平均有不同程度的下调。因此，RT-qPCR结果与iTRAQ数据基本一致，从而验证了iTRAQ的结果。通过使用RT-qPCR对人源黑色素瘤细胞A375M与亲本A375细胞ALDOA基因的转录水平进行检测，发现ALDOA在人源性黑色素瘤肺转移细胞A375M中也呈下调表达。见图4。这一结果在一定程度表明糖酵解信号通路下调在转移性黑色素瘤中是一个普遍现象。

图4 RT-qPCR验证B16F10M细胞糖酵解相关基因转录水平降低

2.4与亲本B16F10细胞相比，B16F10M细胞缺氧耐受能力较弱:根据上述研究，糖酵解/糖异生相关蛋白在转移瘤细胞中呈现下调表达，本研究进一步检测了B16F10细胞和B16F10M细胞的缺氧耐受性。经过低氧环境培养，B16F10M细胞的凋亡细胞比例高于B16F10细胞，其中B16F10M凋亡细胞比率为41.1%，B16F10凋亡细胞比率为27.3%。据此得出B16F10M细胞对缺氧的敏感性高于亲本B16F10细胞。见图5。

图5 B16F10细胞具有比B16F10M细胞更强的低氧耐受能力

3 讨论

癌症患者死亡的主要原因是转移引起的并发症。因此，针对转移性疾病的有效治疗将提高癌症患者的死亡率。大量研究揭示了某些致癌基因参与癌变的过程，如致癌基因Ras的发现。但这些研究多集中在肿瘤发生方面，其研究对象通常为正常细胞和癌细胞。就目前而言，癌症的发生是不可预测的，也就是说，不知道人体体内正常的细胞会在何时何地发生癌变。相反，肿瘤在转移之前可能潜伏数月至数年，因此预防肿瘤的转移相对更容易实现[11]。更重要的是，肿瘤切除患者逐渐增多，这些患者每时每刻都面临着肿瘤转移的风险。大量研究报道，大部分肿瘤细胞从原发灶脱落进入循环系统后被快速消除，其余存活的细胞就成了肿瘤转移的根源。考虑到肿瘤的异质性和肿瘤转移不是由癌细胞扩散引起的偶然事件的观点，本研究假设转移过程中存活的细胞在某些特质上一定不同于死亡的细胞。因此，本研究以小鼠黑色素瘤B16F10细胞株为基础，通过肿瘤转移动物模型构建了肺转移B16F10M细胞株。在之前的研究中，B16F10M细胞展现出比亲本B16F10细胞更高的转移能力[12]。因此，找出潜在的机制显得尤为重要。

定量蛋白质组学技术已经成为癌症研究的有力工具，为研发靶向药物提供了一个独特的途径来发掘关键的生物标志物。本研究运用一种广泛使用的定量蛋白质组学技术iTRAQ，来检测和定量B16F10细胞与存活的B16F10M细胞之间的蛋白表达差异。定量蛋白质组学分析鉴定出322个差异表达蛋白，其中上调表达蛋白147个，下调表达蛋白175个。通过GO分析和KEGG通路分析，确定了这些差异表达蛋白潜在的功能分类：共涉及24条信号通路，包括补体和凝血级联、碳代谢、戊糖磷酸途径、糖酵解/糖异生代谢途径等。本文还利用STRING数据库和Cytoscapae软件分析了这些差异表达蛋白中的PPI。值得关注的是，这两种方法都揭示了糖酵解/糖异生代谢途径是在肿瘤转移过程中发生了显著下调。后续的RT-qPCR结果支持了这一结论。

根据“瓦伯格效应”理论，癌细胞即使在氧气充足的情况下，也倾向于依赖糖酵解代谢进行能量供给，而不是高效的线粒体氧化磷酸化[13]。不仅如此，糖酵解似乎有利于癌症的转移。据报道，小鼠实验证实抑制高转移性细胞的糖酵解显著降低其转移能力[14]。也有研究显示，敲除LDHA可下调TGF-β2和MMP-2的表达，减弱脑胶质瘤的转移[15]。然而，本研究发现，与亲本细胞相比，转移性黑色素瘤细胞的糖酵解水平较低。出现这一现象的原因可能是由于不同肿瘤类型间的异质性造成的。在缺氧耐受实验中，B16F10M细胞比亲本B16F10细胞对缺氧更敏感。由此得出B16F10M细胞比B16F10细胞更依赖线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)，而非糖酵解。根据以往的研究，肿瘤干细胞更依赖于线粒体氧化磷酸化而非糖酵解来进行能量供给[16]。综上所述，肿瘤干细胞转化可以在一定程度上解释肿瘤细胞在转移过程中发生的代谢重编程，或者说代谢重编程可能是肿瘤干细胞转化的动力，其内在机制有待进一步研究。