ELISA抗体检测试剂盒与病毒中和试验对临床牛血清样本中牛结节性皮肤病病毒抗体的检测比对

朱 真，李 静，张 蕾，董春娜，李鹏宇，杜吉革，石守定，肖 进，陈小云

(1.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081；2.中牧实业股份有限公司 农业部兽用生物制品与化药重点实验室 北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心，北京 海淀 100095；3.中国畜牧业协会，北京 西城 100044)

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科羊痘病毒属的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的急性传染性疾病，该病可感染任何年龄阶段、任何品种的牛，引起广泛的皮肤病变和典型的全身型痘病毒感染症状，严重时可导致死亡，其中犊牛死亡率可达100%，成年牛的死亡率在3%～10%，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为必须通报的动物传染病[1]，我国将其列为二类动物疫病。

2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心确诊，新疆维吾尔自治区伊犁州发生LSD疫情，这是我国首次确诊该病[2]。2020年6月5日—7月12日，农业农村部通报了6起LSD疫情[3]。我国邻国俄罗斯、泰国等国家时常发生LSD疫情，给我国的养牛业带来了巨大的威胁[4]。目前，LSD已在我国多地呈逐渐流行趋势，严重危害我国的养牛业。

本研究使用中牧实业股份有限公司制备的3批牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒产品对临床采集的260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清进行检测，并与病毒中和试验(Virus neutralization test,VNT)检测结果进行比较，以期为LSDV抗体水平检测提供合理的检测手段，为免疫程序的制定以及疫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测试剂盒 牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒，采用LSDV多种免疫优势抗原肽作为包被抗原，由中牧实业股份有限公司制备，试剂盒批号分别为LSDV-1、LSDV-2和LSDV-3。

1.1.2 待检血清 共460份血清，均经65 ℃30 min灭活后，从中国兽医药品监察所生物安全三级实验室(The biological safety level-3 laboratory,BSL-3)移出。按照中华人民共和国国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(GB/T 39602—2020)[5]中规定的PCR方法，对460份血清进行PCR检测，均为LSDV抗原阴性，可用于ELISA抗体检测。

1.1.2.1 感染牛血清 260份，编号I 1～I 260，为LSDV临床发病牛血清，采自吉林、山东、河北等疫区，由中国兽医药品监察所提供。

1.1.2.2 健康牛血清 200份，编号Y 1～Y 200，采集自临床未免疫山羊痘活疫苗且牛结节性皮肤病抗原检测为阴性的健康牛，由中牧实业股份有限公司提供。

1.1.3 细胞 山羊睾丸原代细胞，F4代，由中国兽医药品监察所动物实验室制备和保存。

1.1.4 病毒 牛结节性皮肤病病毒(LSDV ZJS01株)，F2代细胞毒，由中国兽医药品监察所制备和保存。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法 以LSDV多种免疫优势抗原肽作为包被抗原，建立间接ELISA方法。(1)在血清稀释板中将待检血清进行适当稀释，阴性和阳性对照血清已稀释，可直接使用。(2)取抗原包被板，将稀释好的待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清加入到抗原包被板中，100 μL/孔。每份待检血清设1孔，阳性对照血清和阴性对照血清各设2孔，加样过程时间跨度应尽量短。振荡混匀(勿溢出)，置37 ℃温箱内孵育30 min。(3)弃去反应液，每孔加入洗涤液300 μL，连续洗板5次后拍干。(4)各孔加入已稀释至工作浓度的HRP-抗牛IgG 100 μL，置37 ℃温箱内孵育30 min。(5)弃去反应液，每孔加入洗涤液300 μL，连续洗板5次后拍干。(6)每孔加入100 μL底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，振荡混匀，置37 ℃温箱内避光反应15 min。(7)各孔加入显色终止液50 μL，振荡混匀终止反应，15 min内测定结果。(8)试验成立的条件：阳性对照孔OD450 nm值应介于1.0～2.2，阴性对照孔OD450 nm值均应≤0.15。(9)判定标准：临界值(Cut-off值)=阳性对照孔OD450 nm均值×0.15；待检血清测定OD450 nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450 nm值<临界值者判为阴性。

1.2.2 VNT方法 于中国兽医药品监察所ABSL-3实验室开展VNT检测。(1)对于260份LSDV感染牛血清，用MEM细胞生长液将待检血清进行连续倍比稀释，从1∶2至1∶256，每个稀释度重复3孔，每孔125 μL。(2)对于200份健康牛血清，用MEM细胞生长液将待检血清进行1∶2稀释，重复2孔，每孔125 μL。(3)用MEM细胞生长液将已测定半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose,TCID50)的LSDV病毒液稀释为200 TCID50/0.1 mL，将稀释好的病毒液加入到血清稀释孔中，每孔125 μL，置37 ℃含5% CO2的培养箱中作用1 h。(4)将中和后的血清—病毒混合液接种于已长成良好单层山羊睾丸原代细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度重复3孔，每孔0.2 mL，置37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。同时设阴性血清对照、病毒对照和正常细胞对照。(5)每日观察记录细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)情况，直至细胞稳定，一般需96～120 h，按Reed-Muench法计算被检血清中病毒中和抗体效价[6]。

2 结果

2.1 牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测 3批牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒对260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的检测结果见表1，3批牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒对260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的阴阳性判定结果一致。对260份LSDV感染牛血清的检测敏感性为86.9%(226/260)，对200份健康牛血清的检测特异性为100%(200/200)。

表1 LSDV感染牛血清和健康牛血清的ELISA检测结果

2.2 VNT检测 对260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的检测结果见表2和表3，VNT方法对260份LSDV感染牛血清的检测敏感性为81.9%(213/260)，对200份健康牛血清的检测特异性为100%(200/200)。

表2 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT检测结果

表3 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT检测结果汇总

2.3 牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒与VNT的检测符合率 2种方法对260份LSDV感染牛血清的检测结果均为阳性的为201份，均为阴性的为22份，检测符合率为85.8%(223/260)，见表4。2种方法对200份健康牛血清的检测符合率为100%(200/200)，见表5。

表4 ELISA与VNT检测LSDV感染牛血清的符合率

表5 ELISA与VNT检测健康牛血清的符合率

3 讨论

LSD是一种病毒性传染病，与我国接壤的蒙古、老挝、马来西亚、柬埔寨、斯里兰卡和泰国等国家一直有LSD疫情发生[7-12]，我国于2019年8月12日首次确诊LSD疫情[2]，随后我国多省均发生LSD疫情[13]。该病主要发生于吸血虫媒活跃的季节，多通过吸血昆虫(蚊、蝇、蠓、虻、蜱等)叮咬传播[14]。该病的传播和流行给我国养牛业带来了巨大的威胁，造成严重的经济损失，可造成病牛消瘦、产奶量急剧下降、皮肤结节处出现凹陷或空洞，使其经济价值降低。结合LSDV依靠吸血虫媒叮咬传播的特性、频繁的动物贸易以及邻国之间的染疫动物的迁徙，将进一步增加LSD的防控难度，我国短期内不会根除LSD[15-16]。

目前我国对于LSD的防控措施主要是扑杀。省级农业农村部门可根据辖区内动物疫病流行情况，对牛结节性皮肤病实施强制免疫[14]。目前国内没有LSD疫苗，根据《牛结节性皮肤病防治技术规范》[14]要求，对疫情危险区县采取山羊痘活疫苗免疫(按山羊5倍剂量)。因此建立一种快速、准确的抗体水平检测方法对免疫程序的制定以及疫病防控具有重要的意义。

OIE推荐的用于LSD的血清学诊断方法包括VNT、ELISA、间接荧光抗体试验(Indirect fluorescence antibody test,IFAT)、免疫印迹试验(Western blot,WB)等[17]。VNT是血清学检测的金标准，但由于VNT试验中需要接触LSDV活病毒，必须在有资质的 BSL-3实验室开展相关试验，且对试验操作要求较高，不适于进行现场大量血清的检测。IFAT方法也需要接触LSDV活病毒，必须在BSL-3实验室开展试验。有研究表明，IFAT方法检测LSDV血清抗体特异性略差，易与羊口疮病毒等发生交叉反应，而且结果判定较为主观[18-19]。WB用于检测LSDV的P32抗原，具有很好的敏感性和特异性，但由于其操作繁琐、耗时较长，限制了其在临床上的广泛应用[20]。ELISA方法是市场上主流的免疫测定技术，具有敏感性好、特异性高、操作简单等优点，已广泛应用于临床检测。

本研究采用的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒由中牧实业股份有限公司研制，该ELISA方法为基于LSDV多种免疫优势抗原的合成肽作为包被抗原建立的间接ELISA方法，以合成肽抗原作为包被抗原具有以下优势：(1)合成肽抗原为人工化学合成的多肽，合成中不需要接触和使用活病毒，不存在生物安全隐患；(2)多肽抗原为针对特定抗原位点设计的，与相应抗体的结合力强；(3)多种优势抗原肽混合包被，大大增加了试剂盒检测的敏感性。为了验证牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒与VNT检测方法之间的符合率，本研究采用3批ELISA试剂盒与VNT方法，同时对260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清进行比对检测。结果显示，3批结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒对260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的阴阳性判定结果一致，对260份LSDV感染牛血清的检测敏感性为86.9%(226/260)，对200份健康牛血清的检测特异性为100%(200/200)。VNT方法对260份LSDV感染牛血清的检测敏感性为81.9%(213/260)，对200份健康牛血清的检测特异性为100%(200/200)。牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒与VNT方法对260份LSDV感染牛血清的检测符合率为85.8%(223/260)，对200份健康牛血清的检测符合率为100%(200/200)。结果表明，本实验室研制的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒敏感性高、特异性好，可用于LSD抗体检测。