食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨

张慧珍

（谱尼测试集团股份有限公司，北京 100194）

李斯特氏菌属隶属革兰氏阳性细菌中厚壁菌门，李斯特氏菌属可划分为6个菌种，即单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。在这6个菌种中只有单核增生李斯特和伊氏李斯特氏菌可以引起动物发病，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症相关。单核细胞增生李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏杆菌病，人畜感染后主要表现为脑膜炎、败血症和单细胞增多，尤以妊娠期妇女，新生儿及免疫功能低下的病人更易感染。因此，李斯特氏菌中最具检测意义的是单核增生李斯特氏菌。

单核细胞增生李斯特氏菌广泛分布于自然界，如土壤、屠宰场、食品生产加工器具和多种食品中，动物或人体也带有此菌。食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的身体健康极具危害，该菌在 4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

当前对单核细胞增生李斯特氏的检测方法主要有传统检测方法、环介导等温扩增反应（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）[2]、以聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）为基础的分子生物学技术等[3-4]。随着科技不断发展，针对食源性致病菌的检测技术也越来越多，新兴的检测方法具有检测周期短、成本高等特点，而大多数食品生产、食品流通企业仍会选择低成本的传统的国家标准检测方法。想要得到精准的检测结果，新兴的检测方法依赖于试验设备，而传统的检测方法更依赖于人员的经验，因此采用传统的方法检测单增李斯特氏菌对试验员提出了更高的要求。

1 目的和意义

本文主要从试剂准备、增菌、划线分离及生化鉴定等方面阐述了对单核细胞增生李斯特检测的一些理解，以期为检测人员依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）进行食品中单增李斯特氏菌检测提供参考，减少人为因素造成的漏判或漏检。

2 国家标准检测方法GB 4789.30—2016的探讨

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测需进行増菌、分离、初筛和鉴定4个连续过程。

2.1 增菌

食品经常同时受到多种致病菌污染，为提高对应致病菌的检出率，样品检测前需先进行抑菌和增菌过程。例如，将检验样品25 g（mL）加入到含有 225 mL LB1增菌液中，均质，（30±1）℃培养24 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，于（30±1）℃培养18～24 h。此过程中，增菌液中的萘啶酮酸和吖啶黄通过抑制细菌脱氧核苷酸的合成机理对革兰氏阴性菌和链球菌起到了抑制作用，同时由于单增李斯特具有耐冷特性，通过低温培养使其快速繁殖生长，便于检出[5]。在进行增菌操作步骤时，应该注意以下问题。

（1）在配制LB1、LB2基础培养基时，应先将李氏增菌基础培养基按照配制比例加热溶解，再进行高温高压灭菌，以防培养基受热不均匀，破坏培养基的营养成分。

（2）配制好的LB1、LB2使用前再按要求量加入萘啶酮酸和吖啶黄素。萘啶酮酸对光较敏感，因此要注意避光保存且LB1、LB2最好现用现添加。吖啶黄素有一定的致癌性，在使用过程中要注意打开安瓿瓶时动作要轻柔，必要时可以用砂轮多摩擦几次瓶颈处，然后再轻轻掰开，以免液体溅出接触到试验人员。

（3）从培养后的LB1中移取0.1 mL转接到10 mL LB2中，因转接量较小、增菌液不均等原因，容易造成漏检，应先将LB1充分混合均匀。在混匀过程中，避免产生大量对人体有害的气溶胶，通过眼鼻黏膜或者吸入方式感染试验人员或污染环境，在整个检测过程中应严格注意无菌操作、动作轻柔及生物安全，并做好人员防护。

2.2 分离

根据国家标准方法，为从增菌液中分离出独立的目标菌，取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于（36±1）℃培养24～48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。典型菌落在柯玛嘉显示培养基上呈现蓝色菌落，有白色晕环。

李斯特显色培养基增补剂的添加及注意事项有以下几点。①增补剂需在基础培养基灭菌后，倒平皿前根据每次基础培养基的配制量添加，在添加前无灭菌过程，所以在称取及配制过程中一定要非常注意无菌操作，以免造成增补剂的污染，致使培养基的大量浪费，称取后严格按照无菌要求密封增补剂以便后期使用。②单增李斯特和其他的李斯特菌有相似的生长特性，它们在传统的培养基上不易被区分，而李斯特显色培养基上可以通过白色晕环来区分，因此白色晕环对于区分单增李斯特和其他李斯特菌具有指导意义。但有时单增李斯特在李显培养基上无白色晕环，通过阳性菌对照试验发现如果增补剂不够均匀或配制好的平皿保存不当均可能出现无白色晕环问题。所以增补剂在配制过程中一定要搅拌均匀，使其完全溶解，最终成为奶油状的均质溶液，避免在显色培养基中出现很多絮状凝块，造成应有的白色晕环不明显，甚至不出现，故在试验过程中采用阳性对照菌株验证培养基尤为 重要。

2.3 初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于（36±1）℃培养24 h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于（30±1）℃培养24～48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。关于初筛过程选菌问题有以下几点建议。

（1）从不同角度观察平皿上的菌落。因GB 4789.30— 2016中规定选择两种选择性培养基，在大量的试验中发现，李斯特显色培养基的区分度很高，首先选择在李显上呈现蓝色菌落，带白色晕圈的菌做初筛，这样可减少部分试验室工作。在选菌时，一定注意要从不同角度观察平皿上的菌落，避免因为光线角度或者菌落生长状态问题，而未发现带有白色晕圈的菌落。同时李显的培养时间也很重要，有些菌株在培养24 h时呈现蓝色菌落，但无白色晕圈，随着培养时间的加长，白色晕圈才会出现，48 h时会很明显。因此，李斯特显色培养基需培养24～48 h。若培养48 h后李显培养基上无带晕圈菌落，则再从PALCAM培养基上进行选择。

（2）选择较大菌落。初次筛选从一个菌落上既接生化，又进行划线纯化确实存在困难，初筛最好选择较大菌落。考虑到单增李斯特氏菌菌体较小，培养24～48 h后可达到1～2 mm，建议先将可疑菌落做平板划线纯化，然后再进行生化鉴定。为节约检测时间，李显培养基上的典型菌落可将纯化平皿和其他鉴定试验一起进行。

2.4 鉴定

在单增李斯特氏菌国家标准检测方法中鉴定包括镜检、动力试验、生化鉴定、溶血试验和协同溶血试验。这些鉴定方式在单增检测中溶血试验和协调溶血试验既是关键试验也是难点。

（1）镜检、生化试验。一般无论是PALCAM还是李斯特显色培养基出现可疑菌落，镜检时菌体大都符合李斯特菌特点，李斯特氏菌呈小的、类似球形的革兰氏阳性杆菌，呈短链，在营养不良培养基中可形成丝状[6]。若在PALCAM或李斯特显色培养基上未呈现可疑菌落，不能进行初筛，一般可进一步通过生化试验，如过氧化氢酶试验、MR-VP试验等，进行排除。若菌落呈阳性反应，则为李斯特 氏菌。

（2）溶血试验。将羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，（36±1）℃培养24～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。若结果不明显，可置于 4 ℃冰箱24～48 h后再观察。在实际工作中，由于单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌产生的狭小的β溶血环很难观察，经大量穿刺不同厚度的血平板试验发现，在琼脂厚度1～1.5 mm的血平板上穿刺更有利于观察溶血现象，且仅需培养24 h。通过调整血平板厚度，极大方便了试验员的观察。血平板中培养基较薄，穿刺时会触及底面，但这并不影响观察狭小的β溶血，因为若菌体无溶血，被接种针穿透处会被菌体填满，狭小的β溶血会在原穿透位置四周部分溶血，而伊氏李斯特氏菌则会出现较大的溶血环。

（3）协同溶血试验。此试验的关键点是金黄色葡萄球菌的菌株类型，并不是所有金黄色葡萄球菌都能参与此试验。GB 4789.30—2016中明确规定所用金黄色葡萄球菌菌株编号为ATCC 25923，试验尝试用ATCC 6538代替ATCC 25923，最终没有出现协同溶血现象。另外，协同溶血试验所用菌株，最好选用相应选择性平板上的单个菌落，不要选择新鲜培养的菌悬液，这样既能保证菌株未被污染，也能防止菌悬液非肉眼可见的散落对试验现象的干扰。在此协同溶血试验中，对于血平板的薄厚要求不高，血平板略薄，培养不足24 h即可观察到协同溶血 现象。

（4）溶血试验。溶血试验中血液一定要新鲜，尤其是单增李斯特菌的狭小的β溶血试验，如果血液不新鲜，观察不到狭小的β溶血，容易造成误判断。建议血平板现配现用，并且最好不要放入电热恒温培养箱中除水汽，这样对红血球有一定的破坏性，致使后续溶血试验现象不能出现应有的试验现象，观察结果出现偏差，造成错判或者漏判。

（5）动力试验。穿刺半固体或者SIM动力培养基，培养基容器应为小的玻璃试管，培养基的量应在试管1/3处较合适，培养基试验前最好放入培养箱适当去除水分，以免接种时有水汽，影响试验现象的观察。穿刺时所用接种针要比较平直，穿刺过程中手部动作要保持平稳，不要出现抖动，可以在穿刺时将接种针的接种杆贴着试管壁，以保证穿刺的 平稳。

2.5 结果报告

结合生化试验和溶血试验结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。

3 结语

本文均是对GB 4789.30—2016检测方法的一些理解和日常检测经验的概述，旨在通过对每个检测步骤关键点的分析，避免人为因素引起的错判和漏判。同时，希望能够给试验人员提供比较详细的检测经验，以便更高效地判断试验现象与试验结果，保证数据的准确性。