液质联用法测定富马酸替诺福韦艾拉酚胺中L-丙氨酸异丙酯

李昌亮，尚金凤，廖正华，蔡立荣，易必新，马晓宁*（.湖南省药品检验检测研究院，长沙 4000；2.药用辅料工程技术研究重点实验室，长沙 4000；.天地恒一制药股份有限公司，长沙 40）

富马酸替诺福韦艾拉酚胺是美国吉利德公司在富马酸替诺福韦二吡呋酯基础上所开发的新一代核苷类逆转录酶抑制剂（见图1）。吉利德公司报道合成富马酸替诺福韦艾拉酚胺的工艺路线主要有两条，一条是2001年报道的早期合成路线，一条是2012年报道的一种制备光学纯替诺福韦艾拉酚胺的不对称合成工艺[1-2]。两条合成路线中均使用了L-丙氨酸异丙酯盐酸盐作为反应物，用量较大会有残留[3-7]。富马酸替诺福韦艾拉酚胺在放置过程中也可能降解产生L-丙氨酸异丙酯。检索发现，L-丙氨酸异丙酯的检测方法较少，虽然有报道高效液相色谱法检测本品中的有关物质，但未将L-丙氨酸异丙酯作为特定杂质进行检测[8]，尚未发现有采用高效液相色谱-串联质谱法检测富马酸替诺福韦艾拉酚胺中L-丙氨酸异丙酯含量的报道[9-12]。因此本研究建立一种液质联用法测定富马酸替诺福韦艾拉酚胺中的L-丙氨酸异丙酯含量，以保障药品质量安全及满足药品监管需要。

图1 富马酸替诺福韦艾拉酚胺（A）和L-丙氨酸异丙酯盐酸盐（B）的结构式Fig 1 Structural of tenofovir alafenamide fumarate（A）L-alanine isopropyl ester hydrochloride（B）

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 超高效液相色谱仪、Thermo TSQ Endura 三重四极杆质谱仪（美国赛默飞）；Mettler Toledo XP205 电子分析天平（美国梅特勒）。

1.2 试药

富马酸替诺福韦艾拉酚胺（批号：200501、200502、200601，含量：98.8%、99.2%、99.7%，天地恒一制药股份有限公司）；L-丙氨酸异丙酯盐酸盐对照品（批号：1-WS-117-1，来源：TRC，纯度：98%）；甲酸、乙腈均为色谱纯；纯化水为Thermo Scientific Barnstead Genpure 纯化水系统制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（见表1）；流速：0.4 mL·min－1；柱温：40℃；进样器温度：10℃；进样量：1 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution

2.2 质谱条件

离子源：ESI 源；检测模式：正离子模式，多重反应监测（MRM）；离子对：母离子m/z132，子离子m/z90、44；接口电压为4.5 kV，接口温度为300℃，DL 管温度为180℃，加热块温度为200℃，干燥器流速为5 L·min－1，m/z132/90 碰撞能量为16 V，m/z132/44 碰撞能量为16 V，碰撞气体为高纯氩气。

2.3 溶液配制

2.3.1 空白溶剂 即稀释剂，为20%乙腈水溶液。

2.3.2 供试品溶液 取富马酸替诺福韦艾拉酚胺约15 mg，精密称定，置25 mL 量瓶中，加稀释剂适量，超声使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 对照品溶液 取L-丙氨酸异丙酯盐酸盐（分子量：167.6）对照品约15 mg，精密称定，置200 mL 量瓶中，用稀释剂适量超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液[L-丙氨酸异丙酯（分子量：131.1）质量浓度约为60 μg·mL－1]；精密量取对照品储备液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，制成对照品溶液（L-丙氨酸异丙酯质量浓度约为0.6 μg·mL－1）。

2.4 专属性

分别取空白溶剂、供试品溶液和对照品溶液进样分析并记录色谱图，结果供试品溶液色谱图中L-丙氨酸异丙酯的保留时间与对照品一致，空白溶剂无干扰，表明方法专属性良好，见图2。

图2 L-丙氨酸异丙酯测定的典型色谱图Fig 2 Typical chromatogram of L-alanine isopropyl ester

2.5 检测限和定量限

精密移取“2.3.3”项下对照品溶液，逐级稀释合适倍数后进样，分别将信噪比（S/N）为3 和10 的质量浓度作为检测限和定量限。结果L-丙氨酸异丙酯的检测限为0.02 μg·mL－1，定量限为0.06 μg·mL－1。

2.6 线性关系考察

分别精密移取“2.3.3”项下对照品储备液0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，制得系列线性溶液。以L-丙氨酸异丙酯峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归计算，结果回归方程为Y＝1.821×107X－1.568×105，r＝0.9994，线性范围为0.06～1.19 μg·mL－1。

2.7 精密度

取“2.3.3”项下对照品溶液，连续进样6 次，记录L-丙氨酸异丙酯的峰面积和保留时间。结果显示，L-丙氨酸异丙酯峰面积的RSD为1.5%，保留时间的RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性和中间精密度

按“2.3.2”项下方法平行配制6 份供试品溶液，进样测定，结果L-丙氨酸异丙酯含量的RSD为2.8%，表明方法重复性良好。不同分析人员在不同日期重复上述试验，结果显示两人共12份重复性供试品溶液中L-丙氨酸异丙酯含量的RSD为2.9%，表明方法中间精密度良好。

2.9 回收试验

精密称取样品9 份（批号：200501），每份约60 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，分别加入一定量对照品储备液，制成L-丙氨酸异丙酯浓度相当于对照品溶液的50%、150%、200%的供试品加标溶液，进样测定，结果L-丙氨酸异丙酯的回收率在102.3%～108.3%，RSD均＜2.0%。

2.10 稳定性

取“2.3.2”项下供试品溶液和“2.3.3”项下对照品溶液，在10℃条件下放置，分别于0、2、4、6、10 和14 h 进样分析，结果各溶液中L-丙氨酸异丙酯的峰面积RSD均小于5.5%，表明溶液在10 ℃条件下稳定性良好。

2.11 耐用性

改变柱温、流速和不同型号色谱柱以考察分析环境的微小变动对方法的影响，发现在各个色谱条件下L-丙氨酸异丙酯的检测均不会受到干扰，方法耐用性良好，结果见表2。

表2 耐用性试验结果Tab 2 Robustness

2.12 样品检测

分别取3 批富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品（批号：200501、200502、200601）进行检测，结果分别为0.044%、0.052%、0.054%，结果均低于拟订限度0.10%。

3 讨论

3.1 流动相选择

本研究在前期方法摸索时分别考察了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1% 甲酸溶液-乙腈溶液3 种流动相。经比较发现，水-甲醇体系下L-丙氨酸异丙酯峰形矮胖、响应较低，通过在水相中添加甲酸能够明显改善上述问题。而在0.1%甲酸溶液-甲醇体系下基线噪音较大，不利于L-丙氨酸异丙酯的检出。因此，为保证试验结果准确，最终选择0.1%甲酸溶液-乙腈。

3.2 离子源选择

在离子源的选择上，先后比较了电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）两种常用的离子源。使用APCI 时发现L-丙氨酸异丙酯响应较低，灵敏度较差；而ESI 可以较好地解决这一问题，因此，最终选择ESI＋为电离方式。

3.3 小结

本研究建立了液质联用色谱法检测富马酸替诺福韦艾拉酚胺原料药中L-丙氨酸异丙酯并完成了相应的方法学验证。结果显示，该方法可以对富马酸替诺福韦艾拉酚胺原料药中的L-丙氨酸异丙酯进行准确定量分析，可为富马酸替诺福韦艾拉酚胺的质量研究提供参考，保障药品质量安全。