番木瓜转录组学研究进展*

陈 燕，郑 剑，余江敏，欧景莉，陈仕淼，何 江，黄雪梅，彭靖茹，朱杨帆，周俊岸，陈豪军，潘祖建

（1 广西壮族自治区亚热带作物研究所，南宁530001）（2 广西农业职业技术大学）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科番木瓜属多年生草本果树，在我国广东、广西、海南、福建、台湾、云南等省区都有种植[1]。番木瓜果实可鲜食、可做菜，木瓜干丝可做成酱菜，木瓜蛋白酶可广泛应用于食品、医药、护肤品等行业，由于种植当年可见收益，具有广阔的发展前景。近年来，受花叶病、枯萎病等的影响，番木瓜产业遭遇瓶颈。通过组培技术培育健康种苗、了解番木瓜抗病机制、培育高产优质品种对番木瓜产业的发展具有重要的理论和实践指导意义。

转录组广义上是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA 及非编码RNA；狭义上指所有mRNA 的集合，可以反映不同生理状况、不同生命阶段及环境条件下基因的表达情况[2]，目前转录组测序技术已经得到广泛的应用[3]。利用转录组学技术对番木瓜进行研究，可为了解抗逆抗病机制及选育高产优质品种提供分子依据。本文对番木瓜在不同方面的转录组研究进行总结和概况，以期对番木瓜的进一步研究和转录组测序的应用提供参考。

1 番木瓜组培的转录组研究

番木瓜的传统育种方式为杂交育种，用实生苗进行繁殖，有优势也有不利因素，优势在于简单易操作，易获得变异植株，选育新品种，但是由于番木瓜植株根据性别可分为雌株、雄株、两性株[4]，实生苗不能保证获得性别一致的植株，只有两性株具有较高的经济价值，如遇到数量较多的雄株，则会影响当年收益[5]，且实生苗没有进行脱毒，容易被花叶病危害，造成减产减收[6]。组培苗相对于实生苗，单株价格较高，但也有其优势，可获得株性一致、株型相同的植株，且繁殖速度快，不受季节影响，用茎尖培养可获得无病毒植株，植株长势及果实品质好，商业价值高。从1974 年首次报道用番木瓜叶柄作为外植体诱导，获得愈伤组织，并培养出体细胞胚至今，国内外番木瓜组培技术已日趋成熟[7-12]。随着转录组学技术的发展，通过转录组研究分析探讨组培过程中的分子调控机制也随之跟进。Zhao 等[13]发现，CpLBD19和CpESR12 个基因在愈伤组织诱导培养基和不定芽诱导培养基上发生了突变，可作为番木瓜愈伤组织诱导和不定芽形成的指标。番木瓜胚性愈伤组织中表达的基因也被发现，如体细胞胚胎发生相关基因有SERK和LEA、生长调节剂相关基因、应激相关基因和次生代谢产物生物合成途径相关基因，在胚性愈伤组织中表达了NAC、WRKY、MYB、WUSCHEL、Agamous-like MADS-box蛋白和bHLH等重要的转录因子[14]。

一些不利于愈伤组织形成的条件和因素也得到了研究，如Jamaluddin 等[15]研究了DET1基因抑制对番木瓜胚性愈伤组织的影响，发现差异表达基因主要参与苯丙素类生物合成和应激反应、发育过程、脂质代谢和对各种刺激的反应。Zhou 等[16]发现，根诱导培养基中添加琼脂和吲哚-3-丁酸（IBA）茎接种外植体不定根的形成受到限制，差异基因参与了厌氧呼吸和活性氧（ROS）代谢途径，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢（H2O2）浓度升高。

转录组学的研究为揭示胚性愈伤组织诱导的早期生物学过程及建立高效的番木瓜离体繁殖生根体系提供了依据。

2 番木瓜性别分化的转录组研究

番木瓜株性、花性复杂，随着温度的变化，花性会有所改变，性别分化可能是由植物生长调节剂（尤其是脱落酸和生长素）、脂类代谢途径及光合作用等转录、表观遗传生物过程共同调控[17-18]，miR394 可能是调控番木瓜性别的重要因子[19]，CpSVPL、CpSERK和CpCAF1AL为性别相关基因，且编码区存在性别相关单核苷酸多态性（SNPs）[20]，CpMS1基因在雄性和两性花发育过程中高度上调[21]。Urasaki 等[22]发现性染色体上的大部分标记位于X 染色体上，通常只有30 个标记同时定位在X 和Yh 染色体上，在候选的Yh 染色体特异性雌性决定基因中筛选出1 个MADS-box基因。不同发育时期，雌性和两性体细胞的差异表达基因不一致，同一性别胚胎发育过程中，基因表达的关键节点在心形胚阶段和鱼雷阶段，胚胎发育候选基因为Cp49[23]。Zhou等[24]研究发现，雄性番木瓜在春季开花较早，这一现象可能与CpSVP和CpAP1的转录变化及其基因特异性低甲基化有关。低温诱导后，雄花出现性别逆转，可能是由表观沉默雌蕊抑制因子的表达造成，并通过生长调节剂信号转导、转录因子及Small RNA 和组蛋白甲基化调控来实现的[25-26]。

3 番木瓜逆境胁迫的转录组研究

由于番木瓜商业品种表现出对干旱胁迫的敏感性，因此对番木瓜的逆境胁迫研究主要集中在干旱胁迫。Estrella-Maldonado 等[27]用转录组（RNA-Seq）方法分析易受水分亏缺和耐水分亏缺的番木瓜样本，共有29 070 条序列被鉴定为代表番木瓜转录组的基因，为进一步了解番木瓜克服水分亏缺胁迫的分子机制提供了有价值的信息来源。和干旱胁迫相关的一些基因也已找到，如CpHSF、CpMYB、CpN AC、CpNFY-A、CpERF、CpWRKY和CpDHN[28-29]。植株的不同部位在感受到不同的干旱程度时，表现出的反应也不一致，在中度干旱胁迫下，叶片和汁液中与细胞周期和DNA 修复相关的过程均上调；而根系对非生物胁迫的响应、生长调节剂信号传导、蔗糖代谢和苏木素合成均上调。在严重干旱胁迫下，所有组织中与非生物胁迫、生长调节剂信号和氧化还原相关的生物学过程都被上调[30]。对干旱胁迫的研究，响应干旱胁迫基因的发现有助于改良这一作物适应干旱的能力。

4 番木瓜病害的转录组研究

番木瓜环斑花叶病（PRSV）、番木瓜畸形花叶病（PLDMV）是影响番木瓜生产的主要病害，转基因方法及药剂防治等是预防病害的有效途径。通过对抗PRSV 转基因番木瓜及感PRSV 番木瓜进行转录组测序发现，许多与转录因子、转运体和生长调节剂生物合成相关的差异表达基因（DEGs）在转基因番木瓜中上调，逆境诱导和抗病基因如MYB、WRKY、ERF、NAC、硝酸盐和锌转运蛋白，以及参与脱落酸、水杨酸和乙烯信号通路的基因在转基因植株中的表达量高于非转基因植株，研究结果为揭示转基因番木瓜抗PRSV 的机制提供了基础[31]。研究发现，壳聚糖N（CTS-N）诱导后，与抗病相关的WAKY基因及CML、CAML钙调蛋白相关基因表达量上调，IAA 生长素基因诱导下调表达，抗氧化酶等活性提高，增强了植株的抗性，可有效防控番木瓜环斑花叶病及番木瓜畸形花叶病[32-33]。鄢兴祥[34]研究发现，香菇多糖10 g/L+宁南霉素0.05 g/L复配剂处理PRSV 侵染的番木瓜，病程相关蛋白（PR1）、乙烯响应转录因子（ERF1）都上调表达，相关防御酶基因上调，次生代谢物得到激活，苯丙烷类、角质、蜡等物质合成，从而提高了植株的抗病能力。

一种由病毒侵染引起的只发生在开花后的番木瓜迟发性黏病（PSD），研究发现SA 信号参与了迟发性黏病的发生，开花前，与逆境和运输相关的基因上调，与代谢相关的基因下调，其中一些水杨酸（SA）激活的基因得到了诱导，如PR1、PR2、PR5、WRKY转录因子、ROS和胼胝质基因，可抑制PSD 的发生，但是开花后，SA 信号的负调控因子：NPR1-抑制剂（NPR1-I/NIM1-I）候选基因、编码UDP-葡糖基转移酶（UGTs）的基因以及几个与乙烯途径有关的基因的转录本的诱导却阻碍了植株的耐受性，从而引起PSD 的发生[35]。

由欧文氏菌引起的番木瓜枯萎病致病机制也有报道[36]。3 条关键通路次生代谢产物的生物合成、微生物在不同环境中的代谢以及ABC 转运蛋白参与了欧文氏菌的致病过程。欧文氏菌侵染早期的生物过程为对刺激的响应，跨膜转运、裂解酶活性和结构分子活性。Ⅲ型分泌系统（T3SS）蛋白家族成员在欧文氏菌致病机制的启动中具有重要作用。

对病害的转录组学研究可以更好地了解致病机制，从而为病害的防治以及选育抗病品种提供依据。

5 番木瓜成熟机制的转录组研究

番木瓜果实的成熟是一个类胡萝卜素积累、肉色和风味改变、果实软化的复杂过程，与氨基酸、碳水化合物、脂类以及核苷酸等的代谢相关[37]，CpACO4、CpPDS、CpXTH30和CpXTH31等4 个番木瓜果实成熟差异表达候选基因可能在番木瓜果实成熟过程中起重要作用[38]。MADS-box、NAC和AP2/ERF基因家族的转录因子（TFs）参与了番木瓜成熟的调控[39]，果实发育和成熟显著诱导CpARF2表达[40]。其中XTH30、GLUB41、PL、PMIS、CPSP、CHLM、MYB类转录因子可能参与了果实成熟衰老进程[41-42]。

TF 家族成员通过参与光信号调控，进而参与调控类胡萝卜素基因的表达，CpbHLH1和CpbHLH2单独调控番茄红素β-环化酶基因（CpCYC-B和CpLCY-B）的转录[43-44]。CpNAC2和CpEIN3a相互作用，激活类胡萝卜素合成相关基因CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的表达，进而参与后熟过程中类胡萝卜素合成[45]。冯力[42]发现3 个叶绿素和类胡萝卜素代谢途径基因CHY-B、CHLM、FER1。外源乙烯加速了番木瓜由绿色向黄色的着色，Chy-b可能在番木瓜果实的着色中起重要作用[46-47]。ABIL46-like和NCED3基因表达和果实转色有关[48]。miR4993-x、miR815-y 和miR7810-x 等miRNA 和果实颜色调控相关[49]。

番木瓜果实软化过程复杂，有明显的细胞壁水解酶，如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等参与该过程[46]，乙烯触发是引起番木瓜果肉快速软化的主要事件，乙烯处理后ACO、ACS和SAM-Mtase基因均上调[47]。其中PYL4-like、PYL9、ABIL2-like、GT、CpEXPA2、XTH30、GLU-B、PL、EGase、EXPA、PMIS等基因表达参与果实成熟软化[42,48,50-51]。miR167-y、miR4993-x、miR3946-x 和miR5059-x等miRNA 和果实软化调控相关[49]。

1-甲基环丙烯（1-MCP）可以有效抑制乙烯信号转导，从而达到保鲜，延长果实贮藏期。但是过高的处理浓度会导致番木瓜果实“橡皮化”，丧失商品价值。郭子娟[52]和李文文[53]研究发现，高于0.3 μL/L 或者1.0 μL/L 的1-MCP 处理番木瓜果实35 d后，番木瓜果实出现“橡皮化”，可能与内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶、β-半乳糖苷酶的活性较低、基因的转录水平也较低，细胞壁结构的完整性得到维持、细胞壁得不到降解，endo-1,4-Xyl、endo-1,3-Glu和β-Gal等基因的表达水平受到抑制有关。长期1-MCP 处理严重改变了果实成熟过程中的代谢产物，降低了三羧酸循环的各种能量代谢物，其中以乙二醇酸循环影响最为显著，苯丙烷途径也受到影响，加速了果实成熟过程中木质素积累，延缓了纤维素降解，可推断细胞壁代谢和生长调节剂信号通路与番木瓜果实成熟障碍密切相关。Cai 等[54]绘制了果实成熟过程中miRNA 和靶基因的网络调控图，发现果实成熟过程中植物生长调节剂信号通路起重要作用，cpa-miR390a和cpa-miR396分别靶向CpARF19-like和CpERF RAP2-12-like，影响乙烯和生长素信号通路，进而影响番木瓜成熟[55-56]。

6 展望

转录组学技术的应用，对深入了解番木瓜组培、性别分化、抗逆、抗病、成熟机制有至关重要的作用，掌握这些理论知识，有助于我们培育抗逆、抗病、高产、优质的番木瓜品种，采后更好地贮藏、保鲜，延长货架期。通过分析当前转录组技术在番木瓜上的应用研究现状，结合国内外植物领域转录组的研究热点，提出3 点建议，以期为番木瓜转录组的研究和应用提供新的思路。

一是加强番木瓜转录组、蛋白组、代谢组等多组学技术结合的研究。目前多组学技术结合对植物的研究已经有了很多的应用。曾建斌[57]运用转录组、蛋白组和代谢组学技术揭示了野生大麦耐低钾的分子机制，发现在低钾环境下，耐低钾大麦通过提高脯氨酸和抗坏血酸等活性氧自由基清除剂的含量来提高抗氧化胁迫能力，苯丙氨酸解氨酶（PAL）介导的苯丙烷类次生代谢途径和乙烯响应代谢通路可用来解释低钾耐性基因型差异的分子机制。周会娜等[58]采用转录组学和蛋白组学技术研究了选自3 个不同香烟区的中部烟叶叶片，了解烟草代谢网络，影响烟叶香型的代谢产物以及与目标代谢物相关的基因。在番木瓜研究上，应用多组学技术进行研究的报道相对较少。Zheng 等[55]通过代谢组学和转录组学的结合分析1-MCP 处理不当导致的成熟障碍机制，发现1-MCP 长期处理后，三羧酸循环的各种能量代谢产物减少，尤其是乙醇酸循环和苯基丙烷途径受影响最大。Agopian 等[59]运用蛋白组学和代谢组学技术分析了乙烯对番木瓜采后品质的影响，发现极性代谢物在刺激成熟过程中表现出不同的模式，膜破裂和氧化过程的变化可能是挥发性化合物产生的原因，改变了番木瓜的一些感官品质，可将γ-氨基丁酸水平作为番木瓜发育和成熟阶段一个强有力的生物学标记。多组学技术的应用，能够进行更准确、更快速的基因功能研究和挖掘，加快高产优质番木瓜品种的选育进程，促进番木瓜产业的发展。

二是加强对番木瓜蛋白酶表达起关键调控作用的基因的挖掘。番木瓜不但营养丰富，番木瓜蛋白酶在食品工业和医学领域应用广泛，目前我国的番木瓜蛋白酶需求量极大，选育高浆番木瓜品种，提高番木瓜浆产量，具有广阔的应用前景。分析番木瓜蛋白酶形成的分子机制，可为选育高浆品种提供参考和理论依据。

三是探索第三代测序技术在番木瓜上的应用。第三代测序技术有读长更长、不需要拼接、能有效避免拼接错误等特点[60]，已成功应用于人类造血组细胞中的巨核细胞，及一些蘑菇状真菌种类的转录组测序[61-62]，尚未见相关技术在番木瓜上的应用。因此，在今后的研究中，应结合更先进的技术和手段，定位高浆、抗病等功能基因并进行新品种的选育，加快育种进程，更好地促进番木瓜产业的发展。