猪流行性腹泻病毒疫苗研究进展

景鼎鼎 ，朱春华，肖方南，王晶晶，张 红，吴琳娇，陈磊清，吴允昆*

(1.福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108；2.福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

1971年，在英国首次分离得到冠状病毒科α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)[1]。PEDV感染仔猪后诱导仔猪的小肠上皮细胞萎缩脱落、Na+/H+通道蛋白活性降低，从而引起厌食、呕吐、腹泻和脱水等临床症状，导致仔猪病情恶化并在几天内死亡PEDV对任何发育时期的猪均有感染能力，免疫系统发育不完善的哺乳期仔猪更容易受到感染，感染后致死率可达100%[3]，保育期和育肥期的猪在感染后出现短时间腹泻症状，成年猪感染后不会出现病症[4]。自2010年始，PED在国内许多地区陆续大规模暴发，之后在英国、美国、加拿大等国家也相继暴发，给世界养猪业造成毁灭性的打击[5-6]。此外，随着PED的全球化趋势愈加明显，截至2021年10月下旬，NCBI网站已公布729条PEDV的全基因组信息，病毒持续变异、毒力显著增强。同时仔猪接种疫苗容易引起应激反应，难以产生有效的免疫应答，所以通过刺激妊娠期母猪产生溶于乳汁的分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)保护仔猪是较为有效的办法[7]。据此，PARK等[8]进一步研究发现妊娠晚期与妊娠早期接种疫苗产生的免疫效果接近，早期接种疫苗不会对母猪造成较高代谢压力，同时提高接种次数会增加初乳抗体含量，极大提高疫苗对仔猪的保护能力。

PEDV疫苗经历长期发展，从传统的灭活、减毒疫苗到亚单位、活载体、转基因植物疫苗以及核酸疫苗等[9]。这些疫苗在PEDV的预防中均发挥着重要作用。此外，基于纳米材料的纳米疫苗，能显著提高疫苗的免疫效果，成为PEDV疫苗研发的热点[10-11]。目前利用纳米递送系统已成功构建出安全性高、靶向性好的多元剂型疫苗。现就PEDV各类型疫苗研究展开综述，并探讨纳米运载系统在PEDV纳米疫苗开发中的潜在应用前景，以期为病毒综合预防提供参考。

1 病毒的结构组成及侵染过程

PEDV基因组为全长约28 kb的单股正链RNA，由5′端帽子(cap)、3′端Poly(A)尾和7个开放阅读框(open reading frames，ORF)组成[12]。如图1所示，核酸编译的4个结构蛋白分别是：刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)。此外，ORF1a和ORF1b编译非结构蛋白nsp1 ～ nsp16。ORF3作为PEDV中唯一的辅助蛋白，通过抑制病毒感染诱导的细胞凋亡促进病毒的增殖[12-14]。

粪便中的PEDV以气溶胶或直接接触的形式传播到口鼻，被口鼻腔黏膜下的树突状细胞(dendritic cells，DCs)摄取并迁移至淋巴结传递给CD3+T细胞，随后通过体液循环转移至肠黏膜结合受体[15]。S蛋白决定PEDV入侵宿主细胞的能力[16]，由 2个区域S1、S2组成，S1识别并结合受体细胞膜表面的功能受体氨基肽酶N(pAPN)与辅助受体神经氨酸Neu5Ac[17-18]，随后具有囊膜结构的PEDV借助网格蛋白、小窝蛋白、脂筏蛋白介导的细胞内吞途径进入内吞小体，低pH和组织蛋白水解酶L引发毒粒结构蛋白的空间构象改变，S2辅助病毒囊膜与宿主细胞膜融合，最后将RNA注入宿主细胞胞质[19]。病毒基因表达的N蛋白辅助其增殖；E蛋白聚集在受体细胞的内质网上，通过抑制视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)介导的信号通路与非结构蛋白协同调控病毒逃避宿主抗病毒天然免疫反应[20]；M蛋白是病毒囊膜上含量最高的跨膜结构蛋白，其保守的N末端部分序列暴露于囊膜外且具有免疫原性，可据此构建中和抗体的识别位点[21]。PEDV早期感染未成熟的肠细胞，后期感染整个空肠的绒毛上皮细胞，致使细胞萎缩并从固有层脱落。此外，病毒感染会导致Na+/H+通道蛋白表达水平、转运效率、mRNA丰度显著下降，从而让仔猪产生腹泻、脱水的症状[22]。

图1 PEDV病毒结构示意图(Cinema 4D作图)

2 传统疫苗

2.1 灭活疫苗灭活疫苗实质是利用物理和化学的手段让受到病毒侵染的组织或细胞失去活性后制备的疫苗。20世纪末，王明等[23]将感染组织用0.2% 的福尔马林37℃恒温振荡24 h，再用氢氧化铝杀菌得到灭活疫苗，有效性试验检测发现主动免疫保护率达85%，被动免疫率可达97.06%，能有效控制PEDV疾病的传播。但自2010后，变异毒株数量激增并分化为GⅠ和GⅡ2种基因型，ZHANG等[24]通过对比PEDV的2种基因型毒株GⅠ(CV777)和GⅡ(CH/JX/01)的致病性和交叉保护效果发现，目前流行的GⅡ型PEDV毒株的灭活疫苗不仅能预防同源毒株，还能抵御GⅠ型毒株的攻击，而利用GⅠ型毒株制备的疫苗对GⅡ型的感染免疫保护效果较差。

灭活疫苗制备简单、安全有效、易于保存运输、工业化成本较低在疫情暴发时能显著控制病毒传播。基于KNU-141112株生产的PEDV灭活疫苗被动免疫仔猪，其存活率提高至92%，并发现口服PEDV灭活疫苗可显著提高DCs数量和IgA水平[25-26]。近期研究通过高效佐剂的替换、优质毒株的筛选等方法提高疫苗免疫效果[27-29]。胞壁酰二肽复合佐剂CVC 1303是PEDV灭活疫苗的一种新型佐剂，接种小鼠后发现小肠中sIgA滴度显著提高[27]。PARK等[28]在灭活疫苗中添加作为佐剂的同源IgG Fc片段可诱导宿主产生强烈的特异性免疫应答。此外，LIU等[29]对比采用GⅡa与GⅡb亚型毒株制备的灭活疫苗发现，免疫仔猪均能诱导高水平IgG和γ干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)，其中GⅡ a亚型能保护仔猪免疫两种亚型毒株，而GⅡ b亚型疫苗对GⅡa亚型病毒的感染仅有25% ～ 50%的保护率。然而，灭活疫苗仍需面对免疫原性较低、持续免疫能力较弱，诱导妊娠期母猪产生的黏膜免疫应答不强烈等挑战。

2.2 减毒疫苗减毒疫苗是指经过传代培养病毒毒力显著下降后制备的疫苗，其能模拟病毒的自然侵染过程诱导宿主产生持续性免疫应答，对仔猪提供高效且长效的保护。童昆周等[30]用Vero细胞系将PEDV G1强毒株传至第83代获得稳定的弱毒株，攻毒试验发现对仔猪的保护率可达94.6%。WU等[31]利用Vero细胞传代培养PEDV CT毒株，与第10和64代毒株测序结果对比，第120代毒株的13个氨基酸突变导致PEDV毒力显著降低，表现出优良的细胞适应性，能稳定传代刺激宿主产生高滴度抗体，可用于开发市场化GⅡa型减毒疫苗。BOONSOONGNERN等[32]通过研究母猪初乳、血清和仔猪血清中针对PEDV的IgA和IgG样本阳性比率(S/P)的相关性发现，较于阴性母猪组的仔猪，接种减毒疫苗的母猪所产仔猪的S/P水平显著提高，母猪血清与初乳、仔猪血清之间的S/P呈正相关。弱毒疫苗因过度弱化、较长的先导开发时间以及可能存在与野毒株重组产生新变种等问题[33]，在疫苗推广过程中有较大争议。为克服上述挑战，SINGH等[34]将PEDV在44℃热处理10 min可逆地展开蛋白结构，然后将其基因组暴露于RNase中碎片化，构建保持完整病毒结构但复制能力极显著降低的减毒疫苗，可刺激机体产生高效特异性免疫，不仅避免毒株过度弱化而且碎片化的基因组难以重组，能显著提高灭活疫苗的安全性。此外，胡兴义等[35]比较使用灭活和减毒疫苗与单一使用其中一种疫苗发现，交替使用疫苗显著提高乳汁中抗体滴度、免疫持续时间和安全性，并使仔猪的死亡率降低至3.69%。但这些研究仅是初步探索，缺乏足够的数据支撑，因此有待于进一步深入研究。

截至目前，国内已经使用了3种基于CV777开发的二价或三价灭活疫苗和减毒活疫苗，并于2015年推出了一种基于GⅡa基因型的减毒二价疫苗[36]。具有细胞适应性的83P-5毒株(P-5V)在日本作为减毒活疫苗用于预防PEDV的广泛传播[37]。

3 基因工程疫苗

3.1 亚单位疫苗亚单位疫苗是指利用表达系统生产病原微生物完全抗原或其部分结构制备的疫苗，可添加佐剂、免疫辅助剂等成分提高其效价。较于传统疫苗，不仅廉价，而且具有更高的安全性、产量和应答效率。现有研究中，LI等[38]使用PEDV抗原核心表位COE(499aa-638aa)替换大肠杆菌鞭毛蛋白的D3区域构建出rSF-COE-3D亚单位疫苗，接种仔猪后海穴能显著提高粪便中sIgA和血清抗体的水平。此外，rSF-COE-3D还能刺激小鼠脾细胞生成更多的CD3+、CD8+T 细胞以及高水平IFN-γ和细胞白介素-4(interleukin-4,IL-4)[39]。PEDV S2区域中含有能够抑制病毒侵染受体细胞的HR1和HR2片段，从HR1、HR2中筛选出6段多肽，表达纯化分析后发现HR2P片段不仅能高效抑制病毒侵染，还能诱导机体持续产生高水平中和抗体[40]。HO等[41]将COE与本氏烟草C端异亮氨酸拉链三聚化(GCN4pII)基序融合，构建出天然三聚体结构的COE，仔猪感染PEDV的症状明显减轻。亚单位疫苗抗原的免疫原性过低，通过将生物型佐剂基因片段与病毒抗原基因片段重组共表达或添加具有佐剂作用的物质，显著增强亚单位疫苗的免疫原性，因此，研发安全高效佐剂在亚单位疫苗的发展过程中至关重要。

3.2 转基因植物疫苗植物表达系统因其可正确折叠、修饰外源蛋白以及提供便利性的给药形式受到广泛关注，但存在外源蛋白表达过低的问题，难以实现规模化。叶绿体在植物内含量丰富，并能半自主表达外源蛋白，据此将外源蛋白基因重组到叶绿体基因组中，实现外源蛋白高效表达[42]。此外，HUY等[43]将大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)与PEDV COE基因融合后重组进生菜基因组上，实现可生食性植物制备疫苗诱导仔猪产生黏膜免疫应答，避免加热破坏抗原结构导致的免疫活性降低。TIEN等[44]发现霍乱毒素B亚单位(CTB)具有可使融合抗原穿过黏膜屏障进而提高抗原免疫原性的能力，在烟草rRNA的控制下将S1D和S1D-CTB序列克隆至烟草叶绿体表达系统中发现CTB可促进S1D的表达，表达效率提高20 ～ 40倍。据此，HUY等[45-46]用CTB基因替换LTB、PEDV S蛋白的S1D片段(636aa～789aa)替换COE，所表达抗原蛋白的溶解性、产量显著提高且诱导的免疫应答更强烈。EGELKROUT等[47]优化PEDV S蛋白基因的密码子适应玉米表达系统后，将其重组到玉米基因组上稳定表达，表达量已达到20 mg/kg。植物系统表达量较过去已有显著提高，但是抗原容易被消化系统水解[42,47]，生物利用度较低导致其应用受到诸多限制，需要进行更多的研究论证，才能使转基因植物疫苗规模化。

3.3 活载体疫苗活载体疫苗是指将PEDV抗原表位基因重组进弱化后的病毒或细菌的基因组中制备的疫苗，其感染宿主可持续合成抗原蛋白刺激机体发生特异性免疫。LI等[48]构建出L.casei-OMP 16-PEDV S重组菌株，用小鼠做免疫原性试验，发现免疫小鼠血清中的中和抗体及IF、INF水平显著升高。LU等[49]将PEDV S基因重组进乙型肝炎病毒基因组中，构建病毒样颗粒疫苗，被动免疫妊娠期母猪并对其仔猪进行攻毒试验。结果表明，该疫苗可诱导母猪乳汁中sIgA含量增加，仔猪临床症状明显减轻且显著降低仔猪的死亡率。YUAN等[50]利用猪痘病毒作为载体表达PEDV QS2014的截短S蛋白(rSPV-St)，发现接种rSPV-St疫苗的血清IgA滴度极显著高于灭活疫苗免疫的仔猪。KE等[51]用高减毒重组水泡性口炎病毒表达删除19个氨基酸的PEDV S蛋白，其通过肌内注射诱导产生强烈的黏膜免疫，攻毒试验发现，仔猪受到感染仅会持续几天轻微腹泻，并且死亡率降低至0%。

活载体疫苗在免疫持续时间、高效应答等方面具有显著优势，但是在实际应用中发现，疫苗的活载体单位存在毒力复壮、目的基因传代丢失、接种后产生副作用等问题[32]。因为疫苗本质是为接种个体提供防护，在安全性方面的顾虑影响了活载体疫苗的市场化，因此提高表达系统的稳定性能显著克服上述问题并加速活载体疫苗上市。

4 核酸疫苗

核酸疫苗又称为第3代疫苗，本质是将病原微生物的抗原表位基因重组到真核表达载体上直接导入受体细胞，利用宿主细胞持续合成抗原诱导机体产特异性免疫应答[52]。SUO等[53]利用pVAX1真核表达载体构建出3种阳性重组子，pVAX1-PEDV-S，pVAX1-PEDV-S1以及pVAX1-IL-18，发现3个重组子联合使用可诱导高效的适应性免疫应答，接种小鼠并攻毒发现，小鼠血清中含有高浓度中和抗体IFN-γ和IL-4。YIN等[54]用PEDV S蛋白基因和猪轮状病毒VP7基因构建pPI-2.EGFP.VP7.S免疫8周龄小鼠，可诱导产生强烈的体液免疫和细胞免疫，较于皮下注射，肌肉注射质粒浓度与免疫效果呈正相关。ZHANG等[55]成功构建出由减毒鼠伤寒沙门菌传递的猪传染性胃肠炎(TGEV)和PEDV S 蛋白的DNA疫苗 SL7207(pVAXD-PS1-TS)，能诱导机体产生高水平的IFN-γ和IL-4并明显缓解PEDV感染后的症状。

核酸疫苗具有较高的灵活性，能够在PEDV GⅡa基因型爆发初期快速制备且高效限制病毒传播，其次表达质粒注入机体内即可诱导宿主产生强烈的黏膜免疫应答，最后能够与多种疫苗联合使用提高免疫效果。克服核酸疫苗稳定性差是目前研究的重点，部分学者认为通过优化密码子、新型佐剂和新型递送系统稳定保护核酸可克服上述问题[56]。

5 纳米疫苗

在过去的10年中，纳米技术在生物医学中的应用取得长足发展，特别是在疫苗递送方面。许多纳米颗粒已被广泛应用于开发动物病原微生物疫苗载体，纳米颗粒的使用为设计疫苗载体系统提供了极大的可能，该系统具有靶向传递、提供稳定抗原、作为有效的佐剂等优点[11,57-58]。MAHONY[57]基于中空二氧化硅纳米颗粒开发出针对PEDV的纳米疫苗，可诱导机体产生极高水平特异性细胞免疫，在宿主体内具有良好的耐受性和生物相容性，能实现靶向递送且显著提高疫苗刺激机体产生的黏膜免疫应答。ZHANG等[58]成功构建智能相变屏蔽层聚合(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-异丁烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸-聚乙丙交酯)(PMMMA-PLGA)，其表面羧基解离产生负电荷保护抗原免受消化系统水解吸收，并在罗非鱼体内随pH上升实现抗原靶向释放，实现纳米疫苗的口服性。目前应用于构建纳米疫苗的材料包括有机、脂质聚合、天然以及无机纳米材料等[59]。有机合成的纳米聚合物材料是将具有良好生物相容性、可降解性的有机物聚合形成的胶状纳米分子，可包裹、吸附抗原并在靶点释放[60]。由仿造细胞膜构建的磷脂双分子层包裹抗原研发的疫苗，能有效运输疏水性抗原，并可通过与聚乙二醇(PEG)混合达到延长免疫应答持续时间的效果[61]。天然纳米材料易于实现自我组装，据此可构建仿生病毒样纳米颗粒，模仿病毒自然侵染宿主的过程，可设计多种剂型用于防治疫情[62]。无机纳米材料结构稳定、靶向性好、可修饰性强，易被DCs和巨噬细胞捕获[59]。通过对纳米材料的优化设计出系统毒性低、表面可修饰的纳米疫苗，这种疫苗不存在病毒复制和重组的风险，可实现递送抗原并增强疫苗免疫原性。

纳米材料在PEDV疫苗研发中也取得一些进展，KIM等[63]基于PEDV结构蛋白成功构建出病毒样仿生人造纳米颗粒，可诱导小鼠产生Th2介导的免疫应答，诱导产生的特异性IgG滴度显著高于灭活疫苗。LI等[62]将PEDV的免疫原蛋白与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)共价结合，鼻内接种妊娠期母猪后对其仔猪攻毒发现，较于被动免疫的仔猪，抗原-PLGA提高宿主淋巴细胞数量、IFN-γ以及中和抗体的水平。此外，CHOE等[64]从大肠杆菌表达系统中纯化得到重组PEDV S蛋白aP2，比较结合aP2的邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素微球(HPMCP)和表达aP2的乳酸乳球菌的免疫效果，两类疫苗均显著提高血清和乳汁中的抗体水平，但HPMCP-aP2更高效，仔猪接种后体质量减轻不显著，仅出现轻微腹泻症状便可自行痊愈。

近10年，随着制备纳米颗粒的技术发展，制备成本和合成条件逐步降低、负载量显著提高，极大地推动纳米疫苗的规模化[58,65]。此外，因为纳米材料的粒径、带电性、表面基团等性质常与纳米疫苗的靶标性、佐剂性、抗原释放能力有关，所以通过对纳米颗粒理化性质的进一步研究，有助于开发出更高效安全的纳米疫苗。

6 总结与展望

PEDV广泛流行造成极大的经济损失，养猪场迫切需要经济、安全且能实现大规模接种的疫苗。人们期望的“理想疫苗”应该具备安全、经济、适用、稳定性高等特点，目前市场上的PEDV疫苗仍需改进。随着PEDV毒株的变异使得疫苗接种变得更加复杂和混乱，对于该病的预防措施变得尤为困难，因此针对最近流行的GⅡ型毒株的有效疫苗正在世界各地积极开发。此外，由于没有明确的目标动物测试模型来证明疫苗的有效性，研究人员进行疫苗开发过程中主要通过设置自己的标准，如粪便稠度和临床症状、病毒输出、存活率以及攻击后血清或初乳中的PED抗体(IgA、IgG和VN)水平等评估疫苗效果[66]。目前，大部分PEDV疫苗可诱导特异性免疫应答，产生高滴度血清抗体，与直接作用于靶点诱导黏膜免疫的PEDV纳米疫苗相比，其生物利用度较低。而在疫苗研制方面，PEDV与β属冠状病毒科的新冠病毒确有相似的一面，具有一定借鉴价值。未来，可期待核酸疫苗与纳米运载系统融合，迅速对PEDV突变基因型做出响应。虽然现阶段只有少数纳米疫苗处于早期临床阶段，但其在预防PEDV方面表现出巨大潜力，因此纳米运载系统的发展可为PEDV的预防提供更优质的策略。