培哚普利对肥胖大鼠肠道微生态的影响

郭艳东，洪汝丹，汪艳蛟，张腾，冯月梅，张霓裳，钱映，杨早改，米飞，殷建忠1,

（1）保山中医药高等专科学校基础医学院，云南 保山 678000;2）昆明医科大学公共卫生学院，云南 昆明 650500）

肥胖是多种慢性病的重要致病因素，已成为全球面临的重大公共卫生问题[1]。WHO 数据显示，1975 年以来，全世界的肥胖人数几乎增加了3倍，现在全球18 岁以上的人有超过6.5 亿肥胖和19亿超重，其中男性超重、肥胖率均低于女性[2]。中国营养学会近日公布《中国肥胖预防与控制蓝皮书》，我国约有4.4 亿成年人超重，其中近1.3亿人肥胖。有研究提示中国成人腹型肥胖率为31.5%，肥胖患病率为14%[3]。最新研究预测，至2030年，中国成人（≥18岁）超重/肥胖合并患病率将达到65.3%[4]。目前，肥胖病因未明，可能与肠道菌群紊乱等多种因素有关[5]。近年来，很多研究指出肠道菌群紊乱与肥胖等代谢性疾病相关[6-8]。本课题组前期研究结果提示云南高原偏寒地区汉族肥胖率为4.99%[9]，明显低于全国水平，本研究推测肥胖发病率低的原因可能是因为高原偏寒环境改变了机体肠道菌群。培哚普利是第3 代血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensinconverting-enzyme inhibitor，ACEI），ACEI 是一种抑制血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的化合物，ACE 参与脂肪细胞的生长和功能，ACE 催化血管紧张素I 生成血管紧张素II（AngII），AngII 可增加脂肪细胞中脂类合成和储存[10]。大量的研究证实ACE 的表达和活性与肥胖有关[11-12]。有研究表明ACEI 治疗可减轻体重[13-14]，但其对于肥胖的具体机制和对健康的影响还未明确。本课题主要是研究培哚普利干预肥胖发生的过程中肠道微生态的变化，探讨培哚普利对肥胖的可能作用机制，以期为培哚普利的高效临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

4 周龄SPF 级雄性Wistar 大鼠；培哚普利叔丁胺片；普通饲料17 kcal% Fat；高脂饲料45kcal%FatD12451；DNA抽提试剂盒E.Z.N.A.®SoilDNAKit；琼脂糖；FastPfu Polymerase；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；建库试剂盒；测序试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药将44 只SPF 级Wistar 大鼠用普通饲料适应性饲养1 周后，随机分成正常组（10只）及高脂饮食组（34只），正常组（B）大鼠以普通饲料喂养，高脂饮食组以高脂饲料喂养5 周造模，[（造模组大鼠体质量-正常大鼠体质量）/正常大鼠体质量]×100%＞20%，判断为肥胖模型制备成功。其中10 只造模失败，予以剔除，将余下24 只按每组8 只随机分为模型组（C）、培哚普利低（D）、高剂量组（E），药物组连续给药3周，每天1次，其他组给同容量的生理盐水。培哚普利低、高剂量组给予培哚普利叔丁胺片0.4、2 mg/kg。给药3周，每周称体质量1 次。本研究通过昆明医科大学医学伦理委员会审核。

1.2.2 指标测定每周测大鼠体重及计算 Lee's指数，8 周后采血，低温离心取血清保存于-20 ℃冰箱，TC（酶法）、TG（酶法）、HDL-C（直接法）、LDL-C（直接法）、UA（尿酶紫外速率法）、GLU（己糖激酶法）含量测定则通过ISO15189 国际认可的第3 方医学实验室昆明金域医学检验所有限公司检测并出具报告。

1.2.3 粪便收集8 周后，收集大鼠粪便34份，快速置于液氮中冷冻，然后转入-80 ℃冰箱保存。所取样本送往上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA v3-v4 区域测序分析。

测序分析过程如下：对送检样本分别进行总DNA 提取和检测，然后进行 PCR 扩增、产物鉴定、纯化、定量、文库制备及库检，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit构建Miseq文库，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序，使用UPARSE 软件和RDP classifier 软件对序列进行OTU 聚类和物种分类注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 培哚普利对大鼠体重及生化指标的影响

2.1.1 培哚普利对高脂饮食大鼠体重增重和Lee's指数的影响由表1 可知，终体重、体重增重、Lee's 指数在不同组间有统计学差异，Scheffe 法两两比较结果提示，与正常组比较，模型组大鼠终体重、体重增重、Lee's 指数升高（P＜0.01），说明模型建立成功；与模型组比较，其余各组大鼠终体重、体重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05），与培哚普利低剂量组比较，培哚普利高剂量组大鼠终体重、体重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 培哚普利对高脂饮食大鼠体重和Lee's 指数的影响（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

表1 培哚普利对高脂饮食大鼠体重和Lee's 指数的影响（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与培哚普利低剂量组比较，@P＜0.05，@@P＜0.01。

2.1.2 培哚普利对大鼠血生化指标的影响由表2 可知，TC 和HDL-C 在不同组间有统计学差异，Scheffe 法两两比较结果提示，与正常组比较，模型组TC 水平降低（P＜0.05），模型组、培哚普利低剂量组、培哚普利高剂量组HDL-C 水平降低（P＜0.05，0.01）。

表2 培哚普利对对高脂饮食大鼠血生化指标的影响[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

表2 培哚普利对对高脂饮食大鼠血生化指标的影响[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 培哚普利对大鼠肠道菌群多样性的影响

Alpha 多样性分析（表3），各组中的Coverage平均值为0.99，说明数据代表了样品中99.00%以上的细菌类型，测序的深度和广度都符合要求。与正常组比较，培哚普利低剂量组的Ace 指数和Chaol 指数升高，与模型组比较，培哚普利低剂量组的Shannon 指数、Simpson 指数、Ace 指数和Chaol 指数均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示低剂量的培哚普利可能有提高大鼠肠道菌群物种丰富度的趋势。

表3 培哚普利对大鼠肠道菌群Alpha 多样性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

表3 培哚普利对大鼠肠道菌群Alpha 多样性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

与正常组比较，#P＜0.05。

如图1A 所示，通过分类操作单元（OTUs）韦恩图，研究了不同组之间的OTU 组成的相似性和重叠性。全部样本共689 个OTU，正常组、模型组、培哚普利低剂量组、培哚普利高剂量组的OTU 总数分别为561、592、619 和592，独有的OTU 为22、9、14 和4。与正常组相比，模型组OTU 总数增加了5.53%（正常组：561；模型组：592），培哚普利低剂量组OTU 总数增加了10.34%（正常组：561；培哚普利低剂量组：619），培哚普利高剂量组OTU 总数增加了5.53%（正常组：561；培哚普利低剂量组：592）；与模型组相比，培哚普利低剂量组OTU 总数增加了4.56%（模型组：592；培哚普利低剂量组：619），但是，培哚普利高剂量组没有增加（模型组：592；培哚普利高剂量组：592）。

图1 培哚普利对大鼠肠道菌群的多样性分析Fig.1 Diversity analysis of perindopril on the intestinal flora of rats

Beta-多样性分析是OTUs 的丰富度信息比较肠道微生物群落之间的相似度程度。如图1B 所示，正常组与模型组分布距离较远，说明群落结构的分布明显不同。培哚普利低剂量组与模型组没有重叠，说明2 组的群落结构具有一定的差异性。

2.3 培哚普利对大鼠肠道菌群物种组成的影响及差异分析

2.3.1 门水平物种组成及差异分析由图2A 可知，在所有的大鼠肠道菌群中，优势物种除了有各组大鼠肠道菌群的优势物种还有变形菌门（Proteobacteria）。由图2B 可知，群落柱形图可解释各组样本的优势物种及其相对丰度，各组大鼠肠道菌群的优势物种主要归属为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、放线菌门（Actinobacteriota）和弯曲杆菌门（Campilobacterota）。由表4 可知，各组大鼠肠道菌群在门水平物种组成有显著差异（P＜0.05）。与模型组比较，正常组厚壁菌门物种组成显著升高（P＜0.05），脱硫杆菌门和弯曲杆菌门物种组成显著降低（P＜0.0.），培哚普利低剂量组厚壁菌门物种组成显著降低（P＜0.01），培哚普利高剂量组放线菌门物种组成显著升高（P＜0.01）。

表4 各组大鼠粪便在门水平上的相对丰度（%/，正常组n=10，其余组n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

表4 各组大鼠粪便在门水平上的相对丰度（%/，正常组n=10，其余组n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2 各组大鼠肠道菌群门水平的优势物种及其相对丰度Fig.2 Predominant species and their relative abundance at the phylum level of rat gut flora in each group

2.3.2 属水平物种组成及差异分析如图3A 所示，所有大鼠肠道菌群在属水平的优势物种主要有29 种（以群落相对丰度≥0.01 为筛选条件），如图3B 所示，各组大鼠肠道菌群在属水平的优势物种主要有18种，如图3C 所示，各组大鼠的肠道菌群在norank_f__Muribaculaceae、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、Lachnospiraceae_NK4A136_group等15 个物种组成上具有显著差异（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，正常组拟普雷沃菌属物种组成显著升高（P＜0.05），螺杆菌属物种组成显著降低（P＜0.01），培哚普利低剂量组拟普雷沃菌属、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group物种组成显著升高（P＜0.05、0.01），培哚普利高剂量组norank_f__Erysipelotrichaceae、Enterorhabdus、葡萄球菌属物种组成显著升高（P＜0.01）。

图3 各组大鼠肠道菌群属水平组成Fig.3 Level composition of the intestinal flora of rats in each group

2.4 大鼠肠道菌群与Lee's 指数、血生化指标的相关性分析

通过spearman 相关系数分析各组大鼠肠道菌群与Lee's index、血生化指标相关性。如图4 所示，在属水平上（取属水平丰度前50），乳酸球菌属与Lee's index、GLU 呈正相关（P＜0.05、0.001），与HDL-C 呈负相关（P＜0.01）；屎豆属菌与HDLC 呈正相关（P＜0.01），与 Lee's index 呈负相关（P＜0.01）；Erysipelatoclostridium与Lee's index 呈正相关（P＜0.05）；norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、norank_f__Erysipelotrichaceae与 Lee's index 呈负相关（P＜0.05、0.001）；瘤胃球菌属（Ruminococcus）、Eubacterium xylanophilum-group与TG 呈正相关（P＜0.05）；考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）与LDL-C 呈负相关（P＜0.05）；Allobaculum与TG呈负相关（P＜0.05）；布劳特氏菌属（Blautia）、Candidatus_Stoquefichus与UA 呈负相关（P＜0.05）。以上结果显示，大鼠肠道菌群变化与Lee's 指数、血生化指标异常存在相关性。

图4 大鼠肠道菌群与Lee's 指数、血生化指标Spearman 相关性分析Fig.4 Spearman correlation analysis of rat intestinal flora with Lee's index and blood biochemical index

3 讨论

随着人们膳食习惯的变化，高脂饮食逐渐增加，其过量摄入会导致脂肪蓄积从而形成肥胖[15]。脂肪过多会增加慢病的患病率和死亡率[16]。近年来，人们发现肠道菌群在肥胖的发生和发展中发挥举足轻重的作用[17-18]。本研究表明，即使灌胃期间仍然给予高脂膳食，和模型组相比，培哚普利也显著抑制大鼠体重增加，这可能是因为培哚普利通过改善肠道菌群结构来抑制体重增加。

16S rDNA 基因扩增测序的分析结果表明，培哚普利低剂量组与模型组的群落结构具有一定的差异性，与模型组相比，培哚普利低剂量组OTU总数增加了4.56%，说明培哚普利可能提高了大鼠肠道菌群的多样性；在门水平上，低剂量的培哚普利能显著降低厚壁菌门物种组成，有升高拟杆菌门的趋势。目前，大量研究证实，“肥胖菌群”特征是厚壁菌门增，拟杆菌门降[19]，拟杆菌门可发酵膳食纤维产生短链脂肪酸，厚壁菌门从食物中获取能量，并以脂肪组织的形式储存[20]，培哚普利高剂量组放线菌门物种组成显著升高，Da Silva等[21]研究结果提示放线菌门和双歧杆菌属与BMI 呈负相关；从属水平来看，低剂量的培哚普利能显著提高拟普雷沃菌属、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group的物种组成，有研究指出拟普雷沃菌属可通过膳食纤维发酵短链脂肪酸[22]。短链脂肪酸可促使胰高血糖素样肽的释放，从而促进胰岛素的分泌，提高机体胰岛素敏感性，减少脂肪沉积[23-24]。

总之，本研究发现培哚普利能够降低肥胖大鼠体重，这可能与培哚普利改变肠道菌群有关。经过培哚普利干预后，放线菌门和拟普雷沃菌属升高，厚壁菌门降低，这可能是培哚普利发挥抑制肥胖的重要生理基础。同时，本研究存在一定的局限性，培哚普利的浓度只有高、低剂量，后期研究需进一步考察不同浓度梯度对大鼠肠道菌群的调节作用。