WNT9B基因多态性与宁夏地区非综合征型唇腭裂的相关性及生物信息学分析

原 凯，马 坚，马晓芳，丁小艳，于丽丽，胡 晨，董 文，黄永清

（1.宁夏医科大学口腔医学院，银川 750004）；2.宁夏医科大学总医院口腔医院口腔颌面外科，银川 750004）

唇腭裂（cleft lip and palate）是最常见的先天性疾病之一，平均发病率约为1/600[1]，我国发病率约为1.4/1 000[2]。该疾病不仅对患儿的面部形态及生理功能造成了极大影响（如唇部缺陷、饮食困难、发音不清、颌面部组织发育异常等），而且为患儿带来了极大的心理障碍及压力。同时，该疾病需要多学科共同参与，治疗周期长，花费巨大，为患儿家庭和社会带来了巨大的经济压力[3]。根据其是否伴发其他先天身体畸形，可将唇腭裂分为综合征型唇腭裂（syndromic cleft lip and/or cleft palate，SCL/P）与非综合征型唇腭裂（non-syndromic cleft lip and/or cleft palate，NSCL/P）。非综合征型唇腭裂（NSCL/P）是指未伴发其他器官畸形，排除于任何综合征范围之内的唇裂伴或不伴腭裂的总称[4]。目前大多数研究学者认为NSCL/P发病是遗传与环境因素共同作用所致[5]。近年来，国内外学者研究发现了与该病相关的多个易感基因，这其中包括干扰素调节因子6（interferon regulatory factor 6，IRF6）、同源异形盒基因1（msh homeobox 1，MSX1）、v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B，MAFB）等[5-7]。

WNT9B（WNT Family Member 9B）基因位于人类染色体17q21，这一染色体区域在某些人群中与NSCL/P的发生密切相关[8]。Juriloff等[9]构建A/WySn小鼠模型，通过遗传互补实验，证实WNT9B基因的突变可导致包括唇裂或腭裂表型在内的一些致命综合征。此外Lan等[10]和Jin等[11]通过构建A/WySn小鼠模型研究发现，WNT9B基因在小鼠胚胎颅面部发育过程中可直接或间接激活经典WNT/β-Catenin信号传导通路，进而调节鼻突及上下颌突的发育融合。然而，由于研究人群及研究方法有所差异，各国学者所得到的WNT9B基因多态性与NSCL/P发病关系的结论也不尽相同[12-14]。本研究选取了WNT9B基因上常见的18个SNP位点进行病例对照研究，探讨WNT9B基因多态性与宁夏人群NSCL/P发病是否存在相关性，并对病例组和对照组间差异有统计学意义的SNP位点进行生物信息学分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2014年1月至2019年12月就诊于宁夏医科大学总医院口腔医院口腔颌面外科的唇腭裂患者504例（男性302例，女性202例）为病例组；本院同期出生的正常新生儿455例（男性214例，女性241例）为对照组。病例组纳入标准：1）患儿除患有先天性NSCL/P外，不伴有其他系统器官的先天畸形或疾病；2）患儿家庭无其他遗传病史；3）患儿双亲精神、智力正常，能接受问卷调查者；4）患儿家庭至少三代为宁夏籍，并长期定居宁夏。对照组纳入标准：新生儿无任何先天畸形或其他疾病；此外还应满足病例组纳入标准中2）、3）、4）项。本研究所有样本采集均获得患者或其监护人知情同意，并已通过宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（批号：2015-076）。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取及基因分型 收集患者及正常新生儿血样5 mL，加入EDTA抗凝剂，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒提取纯化血样中的基因组DNA，之后通过紫外线吸收法和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA样本进行浓度及纯度测定，检测合格样本于-20℃冰箱保存备用。结合HapMap基因库数据、Haploview中的tagSNP以及最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.5作为选取标准，最终选定WNT9B基因上18个常见的SNP，于Ion Torrent测序平台对所选SNP运用AgriSeqTM靶向测序技术进行基因分型。此部分实验委托博奥生物公司完成（通过多方考察和对比，公司后期给予质控标准及验证，以保证数据真实可靠）。

1.2.2 生物信息学分析 通过3DSNP数据库（http：//cbportal.org/3dsnp/）、RegulomeDB数据库（https：//www.regulomedb.org/regulome-search）对目标SNP位点的三维互作基因、三维互作SNP位点及染色质状态进行分析总结。

1.3 统计学方法

对照组基因分型结果进行哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡检验，P＞0.05即符合H-W平衡；采用SPSS 17.0软件对病例组和对照组中所选位点的等位基因及基因型频率进行卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义；同时使用Haploview软件对所选位点进行连锁不平衡及单倍型分析。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

H-W平衡检验结果表明，18个所选SNP位点中，除rs2083798、rs7218180外，其余位点均符合H-W平衡（P＞0.05），之后对符合遗传平衡定律的SNP位点进行下一步分析，见表1。

表1 WNT9B基因中18个SNP位点信息及H-W平衡检验

2.2 WNT9B基因中16个SNP位点等位基因频率分析

对16个SNP位点进行等位基因频率分析，两组间rs62071984位点（P=0.031 8，OR=1.477）和rs1530364（P=0.028 4，OR=1.250）差异有统计学意义，见表2。

表2 WNT9B基因中16个SNP位点等位基因频率分析［频数（%）］

2.3 两组患者连锁不平衡及单倍型分析

连锁不平衡及单倍型分析结果显示，18个SNP位点分别形成3个单倍型块，其中Block 2（rs74941685、rs58818473、rs2083798、rs2083797、rs57258872、rs7212221、rs62071984、rs7218180、rs4968279、rs12150651、rs2165846）中的单倍型AAGCGCAATCG（P=0.047 8，OR=0.696）在病例组和对照组间的差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表3、图1。

图1 WNT9B基因18个SNP位点的连锁不平衡和单倍型分析

表3 WNT9B基因中18个SNP位点单倍型分析

2.4 生物信息学分析

2.4.1 与目标SNP位点相关的三维互作分析3DSNP数据库根据3D染色质结构模型，将染色质环分为两种类型，即环内相互作用（Within loop，跨度＜200 kb）与锚对锚相互作用（Anchor-to-anchor，跨度＞200 kb）[15]。与rs62071984、rs1530364相关的三维互作基因所示，染色质环类型均为环内相互作用，见表4。

表4 与目标SNP位点相关的三维互作基因

与rs62071984相关的SNP位点包括rs118065250和rs184316580；与rs1530364相关的SNP位点包括rs149109510、rs1530365、rs4968282等9个，见表5。在这些位点中，仅有rs4968282在以往报道中与NSCL/P相关，其余位点均未查及与NSCL/P的相关性研究[16]。

表5 与目标SNP位点相关的三维互作SNP

2.4.2 染色质状态分析 在RegulomeDB数据库中查询目标SNP染色质状态，rs62071984在120种细胞系或器官组织中与抑制性多梳蛋白（Polycomb）有关。Polycomb Group（PcG）是一类极为保守的转录抑制因子，在染色质结构发育中起着重要作用[17]；rs1530364在53种细胞系或器官组织中与polycomb相关，在62种细胞系或器官组织中处于沉默子区域，并发挥相应作用影响DNA转录过程，以此调控基因表达，见图2。

图2 目标SNP的染色质状态

3 讨论

NSCL/P作为一类先天性缺陷疾病，其病因复杂，涉及遗传和环境等多种因素，具有显著的遗传异质性[5]。目前多数学者认为NSCL/P由多种基因共同作用所致。因此，破解其中的遗传密码已成为世界学者共同面对的难题。随着对候选突变位点的定位筛选技术更新换代，从遗传标记分子检测技术到基因组学研究，同时加以各类数据库及生物信息学分析工具的辅助，都为其病因机制研究提供了更多途径。

WNT9B基因位于人类染色体17q21区域，这一区域与小鼠clf1区域同源。多位学者研究发现[9，18]，clf1区域主要呈现为WNT9B基因的自发隐性突变，并据此选择A/WySn小鼠构建动物模型，结果提示，WNT9B基因可对胚胎颅面部发育产生重要影响。近年来，通过对来自不同地区的不同人群进行基因组学研究后发现rs4968282、rs1530364、rs197915等多个新的突变位点，但研究结果未能表现出一致性[13-14，16，19-20]。本研究选取了WNT9B基因上18个SNP位点进行病例对照研究；排除不符合H-W平衡的SNP位点，结果表明，2个SNP位点（rs62071984，rs1530364）的差异有统计学意义，提示这2个SNP位点与宁夏地区NSCL/P的发病可能具有相关性。连锁不平衡及单倍型分析表明，3个连锁Block中，位于Block 2的WNT9B AAGCGCAATCG单倍型与NSCL/P风险降低相关（P=0.047 8，OR=0.696），且rs62071984位于Block 2内，提示Block 2是很有价值的研究区域。虽rs1530364未分布于连锁Block内，但在先前的报道中，Fontoura等[13]对巴西人群中70例核心家系样本进行研究发现，WNT9B基因rs1530364与NSCL/P具有很强的相关性；同时Jain等[21]也通过实验测序发现，WNT9B基因rs1530364与南印度人群NSCL/P的发生具有密切关系。但Shibano等[14]通过对日本人群中74例核心家系样本及14例NSCL/P患者父母样本进行二代测序后，结果显示，WNT9B基因rs1530364与日本人群NSCL/P不存在相关性。结合本研究所得结果，rs1530364虽表现出与宁夏地区NSCL/P具有相关性的可能，但与既往不同人群研究结果未能表现出高度一致，这更表明了NSCL/P具有很强的人群特异性。

NSCL/P作为一类多基因遗传疾病，基因间的相互作用在其发病过程中起着重要作用。随着三维基因组学的发展，基因组结构被认为是一维的看法被打破，基因的三维空间结构为其发挥功能提供了更多研究可能[22]。染色质环结构通过减小调控元件与靶基因之间的距离，从而促成二者之间的相互作用[23]。同时，染色质环结构中多以“增强子-启动子”成环最为多见，该成环构象经常改变临近基因的表达状态[24]。本次研究通过3DSNP数据库分析发现与目标SNP三维互作的基因包括GOSR2及WNT9B；与其三维互作的SNP位点共有11个，其中仅有rs4968282在以往报道中与NSCL/P相关。

GOSR2基因同样位于小鼠clf1区域，Juriloff等[18]通过A/WySn小鼠模型研究发现GOSR2基因在小鼠胚胎10～11 d头部的表达水平与正常小鼠模型相比，差异无统计学意义。三维基因组学的出现，为GOSR2基因与NSCL/P之间的联系提供了更多的研究方向。

rs4968282位于WNT9B基因的内含子区，Nikopensius等[16]对来自欧洲的300例NSCL/P患者进行病例对照研究，结果表明，WNT9B基因rs4968282的G等位基因与NSCL/P风险降低有关（OR=0.688；95%CI=0.548~0.865）；而在单倍型分析中，WNT9B CA单倍型与NSCL/P风险增加有关（P=0.001 34），WNT9B GG单倍型与NSCL/P风险降低有关（P=0.001 55）。而Mostowska等[19]通过对波兰人群进行研究发现WNT9B rs4968282与NSCL/P无统计学关联。在一项包含179个基因中的5 437个变异的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）中发现，虽然rs4968282未达到全基因组显著性阈值水平，但达到了候选基因显著性水平（P=2.65×10-4）[12]。

本次研究通过RegulomeDB数据库分析目标SNP的染色质状态发现，rs62071984在多种细胞系或器官组织中与polycomb相关。polycomb抑制复合物（polycomb repressive complex 2，PRC2）理论上可抑制WNT信号，从而影响多种生物发育进程，包括骨骼肌分化[25]、红细胞生成[26]和肠道稳态[27]等。WNT信号通路可参与调节多种细胞活动，并在多种器官发育过程中起着重要作用，尤其与颌面部形态发育关系密切。既往多项研究表明，WNT信号通路与NSCL/P相关，并通过A/WySn小鼠等动物模型得到证实[10]。因此PRC2与WNT信号通路之间的联系可为rs62071984与NSCL/P的研究提供更多思路。

本研究通过病例对照实验发现，WNT9B基因rs62071984、rs1530364与宁夏地区NSCL/P相关，WNT9B AAGCGCAATCG单倍型与NSCL/P风险降低相关；并通过3DSNP、RegulomeDB数据库得出与其相关的基因、SNP位点及染色质状态。虽然本次实验H-W平衡结果中未发现rs1530364参与连锁重组，但生物信息学分析结果提示其与rs4968282关系密切，并与NSCL/P具有较强的相关性。同时对rs62071984的染色质状态分析发现，PRC2与WNT信号通路之间的联系可为NSCL/P的病因学研究提供更多研究方向。