宁夏一株人呼吸道合胞病毒B亚型全基因组基因特征分析

王新宁，吴忠兰，李宗倍，吴玉灵，苏艳艳，马学平

（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院；宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004；2.宁夏疾病预防控制中心，银川 750004）

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）是婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群急性下呼吸道感染的重要病原体之一[1]。HRSV引起2岁以下儿童急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infections，ALRTI）的感染率高达97%[2]，常见症状为咳嗽、咳痰、发热、呼吸困难和喘憋[3]。HRSV只有1个血清型，根据其对单克隆抗体的抗原性和遗传性的差异可分为HRSV-A和HRSV-B两大亚型：根据G蛋白的第二高变区（the second hypervariable region in the G protein，HVR2）的核苷酸序列的基因特征，将HRSV-A划分为18个基因型（GA1～7、ON1～2、NA1～4、SAA1～2、TN1～2和CBA）[4-7]，将HRSV-B划分为39个基因型［BA1～14、GB1～13、SAB1～4、BAc、URU1～2、CB1（GB5）、CBB、BA-CCA、BA-CCB和THB］[5，8-10]。本研究对2020年宁夏地区新型冠状肺炎流行期间具有下呼吸道感染症状的人群进行多病原检测，并对其中一株HRSV-B全基因组序列进行了测定，结合GenBank数据库中世界其他地区报道的56株HRSV-B亚型病毒G基因组序列进行了对比分析，研究其基因特征，丰富了我国HRSV基因数据库，也为HRSV的快速诊断方法的建立、评价预防性治疗单克隆抗体提供了核苷酸和氨基酸的基础数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

从2020年1月20日至2020年11月20日宁夏地区具有呼吸道感染症状且新型冠状肺炎监测为阴性病例中随机选取480例为研究对象。所有研究对象在就诊后2 h内采集鼻-咽拭子、咽拭子、痰、肺泡灌洗标本，并尽快送往实验室保存于-80℃低温冰箱。所有患者及未成年人家属均签署知情同意书，自愿协助本次实验研究。

采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time reverse transcription polymerase chain re－action，real time RT-PCR）对甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、呼吸道腺病毒（RAdV）、人偏肺病毒（HMPV）等8种呼吸道病毒进行检测。将筛选出的所有HRSV阳性样本提取核酸后送至上海伯杰医疗科技有限公司进行测序，最终有一株全基因组测序成功，本文中该病毒命名为China/ningxia/2020-02。此病毒株来自2020年2月23日海原县人民医院收治住院的1例发热病例，患儿1岁5个月，男，汉族，既往体健，2月21日出现发热、咳嗽、咳痰。22日症状加重，转送到县医院发热门诊就诊：体温37.8℃，白细胞（WBC）7.14×109/L，淋巴细胞百分比31.7%，中性粒细胞百分比57.5%；X线片示：双肺纹理轻度增粗。根据临床表现、流行病学调查和新冠病毒核酸检测结果分析，考虑为支气管肺炎。

1.2 试剂及仪器

病毒核酸快速提取试剂盒购自硕世生物科技股份有限公司，甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法）、RSV/PIVⅢ/PIVⅢ（三重荧光PCR法）、PIVI/HMPV/人偏肺病毒（三重荧光PCR法）均购自上海伯杰医疗科技有限公司；硕世全自动核酸提取仪购自硕世生物科技股份有限公司，7500 Fast Real-Time PCR System、QuantStudioTM 7均购自美国ABI公司，生物安全柜购自美国Baker公司。

1.3 方法

1.3.1 呼吸道多病原检测 使用病毒核酸快速提取试剂盒进行病毒总RNA的提取，提取方法按照试剂盒说明书的步骤操作，提取的核酸存放于-70℃冰箱保存备用。采用RT-PCR方法进行呼吸道多病原检测，检测方法参照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 HRSV阳性样本的全基因组序列测定 核酸提取后及时送往上海伯杰医疗科技有限公司进行二代病毒全基因组测序。

1.4 序列分析

通过SPAdes软件对病毒基因组进行整理后拼接成fasta序列文件。经NCBI BLAST序列比对后，使用DNAStar软件中的MegAlign分析核苷酸序列同源性确定基因亚型。最后用MEGA 7.0软件对China/ningxia/2020-02与GenBank中登录的其他RSV毒株的全基因组、G基因进行多序列联配确定基因型，采用Clustal W进行多序列比对，使用邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建进化树，选择p-distance法估计遗传距离，Bootstrap值选择1 000次引导重复测试准确性。

1.5 全球代表株筛选

通过在NCBI网站进行检索，搜索关键词“Human respiratory syncytial virus+基因型”或“HRSVB”进行查询，通过阅读大量中英文文献整理代表株序列，筛选出不同国家、不同年份的全球代表株，见表1。

表1 全球代表株序列信息

2 结果

2.1 呼吸道多病原检测结果

480例具有呼吸道病毒症状者中，检出呼吸道病毒的有51例，阳性率为10.6%，其中RSV检出率最高（4.0%）（19/480），其余阳性率从高到低分别为FluA（2.7%）（13/480）、RAdV（2.3%）（11/480）、HMPV（0.8%）（4/480）、PIVⅡ（0.2%）（1/480）、FluB（0.2%）（1/480）、RSV与RAdV合并感染（0.2%）（1/480）、RAdV与HMPV合并感染（0.2%）（1/480）。

2.2 核苷酸序列及其同源性

测序结果经SPAdes软件拼接后得到China/ningxia/2020-02的全基因组序列为15259 bp核苷酸，经NCBI BLAST序列比对后，出现了100条同源性较高的B亚型序列，均在99.34%～99.63%。选取其中一些不同年份、不同国家地区的8条B亚型代表株、RSV-A亚型的原型株Long株（AY911262）以及RSV-B亚型的原型株9320株（AY353550）的基因全长核苷酸序列，利用DNAStar软件中的MegAlign比对核苷酸序列同源性，见图1。结果表明，China/ningxia/2020-02与RSV-A亚型原型株Long株的核苷酸同源性最低为80.9%，与RSV-B亚型原型株9320株的核苷酸同源性为96.0%，也提示了宁夏首株HRSV为B亚型。与其他代表株的核苷酸同源性均在99.0%以上，与2018年英国流行株（MZ515970）及2017年澳大利亚流行株（MW160823）的核苷酸同源性最高为99.6%。

图1 RSV全长序列核苷酸同源性比对结果

2.2.1 G基因比对结果HRSV的G基因变异度大，宁夏首株（B亚型）G基因与RSV-A亚型原型株Long株的核苷酸序列同源性仅为65.9%，氨基酸序列同源性仅为54.0%；该株与RSV-B亚型原型株9320株的核苷酸序列同源性为89.0%，氨基酸序列同源性为86.3%；而与其亲缘关系最近的8个毒株的核苷酸序列同源性在98.6%～99.0%，氨基酸序列同源性在96.8%～97.8%，见图2A、B。

2.2.2 F基因比对结果HRSV的F基因保守性高，宁夏首株（B亚型）F基因与RSV-A亚型原型株Long株的核苷酸序列同源性为82.1%，氨基酸序列同源性为89.2%；该株与RSV-B亚型原型株9320株的核苷酸序列同源性为95.9%，氨基酸序列同源性为98.3%；而与其亲缘关系最近的8个毒株的核苷酸序列同源性在99.1%～99.6%，氨基酸序列同源性在99.3%～99.8%，见图2C、D。

图2 主要糖蛋白基因及氨基酸序列比对结果

2.3 全基因组系统发生树分析

将NCBI BLAST比对后选取的8条代表株以及RSV-B亚型的原型株9320株的全长核苷酸序列，用MEGA7.0软件进行序列比对后，并用NJ构建系统进化树。可以发现，China/ningxia/2020-02与2018年英国流行株（MZ515970）及2017年澳大利亚流行株（MW160823）同属于一个分支，bootstrap值为100%，表明亲缘关系最为接近，与RSV全长序列核苷酸同源性比对结果结论一致，与2013年中国广州（KM517573）及原型株9320株亲缘关系较远，见图3。

图3 合胞病毒B亚型分离株的全基因组进化树

2.4 G基因组系统发生树分析

本文将所测得的1株HRSV-B亚型全基因组序列（China/ningxia/2020-2）和56株全球代表株进行了比对和分析，56株全球代表株分别来自22个国家，覆盖56年（1962—2018年），包括BA、URU、GB、CB1（GB5）、SAB和BAc各型的代表毒株。基于G蛋白基因HVR2联配后构建的系统进化树结果表明，China/ningxia/2020-02毒株G基因在792nt之后有60nt的插入，属于典型的BA型，并且与BA9基因型代表株聚集在同一分支上，因此划分为BA9基因型，见图4。

图4 合胞病毒B亚型分离株的G基因HVR2进化树

3 讨论

呼吸道病毒主要通过空气和接触传播，具有感染力强、发病急、传播速度快、病后免疫力不持久等特点。本研究显示，调查期间患者感染率最高的病毒是HRSV（4.0%），高于北京地区2015年全人群的HRSV（2.17%）的阳性率[11]，低于西安市2009—2014年全人群的HRSV（10.78%）的阳性率[12]。由此可见，不同的地区HRSV感染的阳性率存在着差异。这可能与研究的时间、地点及采用方法的不同有关，本研究还存在样本量少的情况。

HRSV的流行特点因为年份和地域的不同而在流行中呈现出不同的变化，可表现为A、B亚型同时为主要流行亚型，也可以表现为A、B亚型交替流行，即以其中一种亚型为主要流行亚型。目前全球的流行亚型为HRSV-A中的ON1型和HRSV-B中的BA9型。本研究中宁夏测序成功的一株HRSV经分析确定为B亚型中的BA9型。BA基因型毒株首次分离于1998年[13]，1999年首次报道[14]是B亚型中G基因C-末端含有60个核苷酸重复插入序列的新型基因型，自此以后，BA基因型进化为14个基因型（BA1～14）并在全球出现广泛流行。BA9基因型首次于日本报道，Dapat等[15]分离自2006—2007年的流行季节。我国第一个BA9基因型由Song等[7]扩增自2006年的标本。2008—2014年，BA9基因型逐渐流行成为我国优势基因型。黏附蛋白G以膜结合型和溶解型两种形式存在，能使病毒吸附于宿主细胞上，导致感染开始。但在缺乏该蛋白的情况下，病毒仍能在体外进行感染，这种感染可能是通过融合蛋白F或胞饮作用完成。G蛋白是RSV结构蛋白中变异最显著的蛋白，其抗原变异可能是RSV逃避免疫监视、引起反复感染的原因。近年还发现G蛋白上存在一个CX3C模序，该模序在RSV感染中起着重要作用。因此，了解G蛋白的结构、功能及免疫表位，对研究RSV的感染机制及研制亚单位疫苗具有重要意义。F蛋白在RSV病毒株间高度保守，但单克隆抗体及疫苗的广泛使用可能使F蛋白面临巨大的免疫选择压力，导致可逃逸抗体的突变被选择出来，影响抗体与F蛋白的结合能力，故利用基因测序技术选择相对保守的F蛋白表位作为抗体靶点可减少免疫逃逸的发生[16]。

总之，宁夏地区目前尚未有系统完整的呼吸道传染病监测体系，本研究仍处于初步探索阶段。宁夏首株HRSV的全基因组同源性分析及系统进化树的构建为公共卫生学研究提供了分子流行病学依据，但研究涵盖时间较短。欲全面掌握宁夏地区呼吸道病毒多病原的流行和遗传特征，还需后续进行系统而连续的监测工作。本研究只对一株HRSV进行了全基因组分析，基因型的确定也并不能代表本地区的优势基因型的流行，仍需要进一步开展持续性、大规模的研究。