二甲双胍通过SHH 通路对髓母细胞瘤抑制机制的研究进展

章钟鼎，方黄毅，盛汉松

1.温州医科大学附属第二医院神经外科，浙江 温州 325035；2.温州医科大学第二临床医学院，浙江 温州 325035

髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是儿童常见的颅内恶性肿瘤，占儿童颅内肿瘤的10%～20%，15 岁以下儿童年发病率约为5/100000，成年人偶发[1]。MB 多发于后颅窝的小脑蚓部及第四脑室，可导致小脑功能障碍和颅内压升高，患者可出现恶心、呕吐、头痛、行为改变、共济失调和眼球震颤等症状。MB 恶性程度高，生长迅速、易早期转移、术后易复发，总体预后不佳。通过手术、放化疗等治疗，MB 患者5 年生存率可达70%～85%，但因长期接受放化疗，患者生存质量低下。此外，3岁以下MB 患儿预后较差，仍是临床治疗的难点。

Hedgehog 信号通路最早由Nusslein Volhard 和Wieschaus在果蝇中发现[2]。在哺乳动物中，根据配体不同Hedgehog 被分为Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）和Desert Hedgehog（DHH），其中对SHH 信号通路的研究最多。在哺乳动物中，SHH 信号通路参与胚胎发育过程中细胞的增殖分化及神经系统的形成，胚胎期后仅参与部分组织的维持和修复[3]。SHH 信号通路的异常激活会导致MB 在内的多种肿瘤发生，针对SHH 信号通路的抗癌靶向药也成为目前研究的热点。

二甲双胍是一种治疗Ⅱ型糖尿病的口服降血糖药物。早期研究发现在长期服用二甲双胍的Ⅱ型糖尿病人群中乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发病率降低，生存期明显延长[4]。随后，人们发现其对包括MB 在内的多种肿瘤具有一定疗效，其抗癌作用成为研究的热点。在SHH 型MB 中，二甲双胍主要通过激活AMPK 而直接和间接抑制Gli1 的转录活性以抑制SHH 信号通路，对MB 有潜在的治疗作用。

1 SHH 信号通路在MB 中的异常激活

随着分子生物学的发展，MB 被分为4 种亚型：WNT 型、SHH 型、第3 组型和第4 组型。不同亚型表现出巨大的遗传学和生物行为学差异，为靶向治疗提供了依据。SHH 型约占MB 的30%，发病率在年龄上呈双峰分布（多发于＜5 岁和＞16岁人群），病理上多为经典型和促纤维增生／结节型MB，5 年生存率约为70%[5]。SHH 通路中的基因异常激活可导致MB的发生和进展。

SHH 信号通路主要由SHH 配体、膜受体蛋Patched 1（PTCH1）、G 蛋白偶联受体样蛋白（Smoothened，SMO)、融合基因抑制剂（supressor of fused，SUFU）以及核转录因子蛋白Gli1/2/3 构成。SHH 配体是SHH 信号通路的启动信号，其转运释放与转运样蛋白Disp 有关，但其调控机制仍未阐明[6]。SHH 配体未与细胞膜上的PTCH1 结合时，PTCH1 抑制SMO进入细胞膜，Gli 就会被PKA、CK1α 和GSK3β 磷酸化而失去转录活性，通路处于抑制状态；当SHH 配体结合到PTCH1 时，PTCH1 对SMO 的抑制作用被解除，SMO 被GPRK2 和CKI 磷酸化并与SUFU 结合，使全长Gli 进入细胞核，SHH 信号通路被激活[7]。Gli 蛋白在核内可通过调节各种基因的转录而在机体的生长、发育以及癌症中发挥重要作用：Gli 可以作为核转录因子正性调控Cyclin D1/D2 和MYC、Blc-2 等癌基因，促进细胞增殖和诱导癌症发生；可调节Sox2 和Nanog 的表达介导干细胞的自我更新；还可以通过上调血管生成素和血管内皮生长因子（VEGF）的表达促进血管生成[8]。此外，Gli 调控的靶基因还包括PTCH 和Gli1，可形成SHH 信号通路的反馈调节。Gli 1/2/3 的作用略有差异，其具体机制差异尚未被完全阐明，目前针对Gli 1 的研究最多，相比Gli 2 和Gli 3 其在癌症中似乎表现出更为重要的作用。

正常情况下SHH 信号通路在哺乳动物胚胎发育过程中必不可缺，参与调控细胞的增殖分化以及神经管、牙齿、中轴骨和四肢的形成，在胚胎发育阶段后仅参与部分组织的维持和修复[3]。在中枢神经系统中，SHH 信号通路主要在胚胎期调控小脑发育，但若在胚胎期后异常激活则可导致MB 的发生，其异常激活与PTCH1、SUFU、SMO 基因的失活突变以及Gli1/2 基因的激活有关[1]。其中，PTCH1 的失活突变是导致SHH 型MB 的最常见原因（占SHH 型MB 的43%，占所有MB 的30%），其失活可导致对SMO 的抑制作用解除，从而使SHH 信号通路被激活。此外，TP53 突变在MB 中较为常见，与其他亚型的MB 不同的是TP53 突变的SHH 型MB 往往预后较差，因此WHO 又将SHH 型MB 分为TP53 突变组和TP53 野生组两种亚组。在细胞层面上，最近有研究发现OLIG2+祖细胞是SHH 型MB 的起始瘤细胞，OLIG2+表达过度者预后不佳[9]。

2 当前针对SHH 信号通路的靶向药物

针对SHH 通路的药物有SMO 抑制剂、Gli 抑制剂和SHH配体抑制剂。SMO 抑制剂研究最多，一般通过结合SMO 阻止其构象改变而阻止SHH 通路激活。目前已有维莫德吉（vismodegib，GDC-0449）、索尼吉步（sonidegib，NVP-LDE225）和格拉吉布（glasdegib，PF-04449913）被批准上市。维莫德吉和索尼吉步被批准用来治疗晚期基底细胞癌，也被用于MB的治疗。但在MB 的治疗中，两者都因SMO 突变较为普遍而表现出严重的耐药性（如维莫德吉对D473H、E518K 型SMO突变患者无效），且存在疲劳、恶心、体重减轻和味觉丧失等不良反应。格拉吉布则用于治疗急性髓细胞性白血病。

SHH 配体抑制剂和Gli 抑制剂尚处于起步阶段，它们分别处于SHH 信号通路的始端和末端，解决了SMO 抑制剂因SMO 基因突变而产生的耐药性。其中，Gli 作用于下游癌基因，其转录水平和SHH 型MB 患者的预后负相关，是目前研究的热点。Gli 抑制剂GANT61、GANT58、FN1-8、pyrvinium（FDA 批准作为驱虫药）和三氧化二砷（ATO）（FDA 批准用于治疗急性早幼粒细胞白血病）等已在临床前研究中有较好的表现[10]。研究发现，在MB 中GANT61 能够通过抑制GLI1 转录因子，下调CyclinD1 的表达，抑制MB 细胞增殖并促进其凋亡[11]。此外，pyrvinium 也被证实可通过破坏Gli 蛋白稳定性来抑制MB 增殖，其与SMO 抑制剂联合使用可延缓耐药性产生且疗效更佳[12]。ATO 在MB 治疗中的前景亦受到部分学者关注。SHH 配体抑制剂的研究则较少，目前仅有RU-SKI 43 和5E1 处于临床前研究阶段。

3 二甲双胍对MB 的潜在抑癌作用机制

二甲双胍是作为降血糖药物，可增加细胞对胰岛素的敏感性，并通过激活AMPK 等通路，发挥抑制肝葡萄糖输出、促进骨骼肌摄取葡萄糖以及抑制肠道吸收葡萄糖等作用。目前认为二甲双胍的抑癌作用也主要通过AMPK 途径，在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、肺癌、子宫内膜癌以及神经胶质瘤等肿瘤的体外细胞实验和动物实验中，二甲双胍表现出良好的疗效[13]。在MB 中，二甲双胍可直接或间接激活AMPK 信号通路，发挥AMPK 信号通路对SHH 信号通路中Gli 蛋白转录的抑制作用，从而抑制下游癌基因表达来抑制肿瘤细胞生长。

AMPK 是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白酶异源三聚体，由α-催化亚基、β-调节亚基和γ-调节亚基组成，在进化上高度保守。α-亚基上第172 号苏氨酸残基的磷酸化是AMPK 的启动信号，AMP／ATP 比值升高、钙离子浓度升高以及一些小分子物质的直接作用都可以促进AMPK 通路的激活[14]。激活的AMPK 通路可以增加分解代谢并降低合成代谢，从而维持能量平衡；同时，AMPK 可调节下游与肿瘤相关的通路（如mTOR 和SHH 等），发挥抑癌作用。二甲双胍主要通过线粒体电子传递链复合体I 的电子传递，阻止ATP 生成，使AMP／ATP 比值升高，从而间接激活AMPK 信号通路[15]；二甲双胍也可通过直接磷酸化AMPKα-催化亚基上的第172 号苏氨酸残基以及结合γ-调节亚基以激活AMPK 信号通路[16]。

Gli 是SHH 通路的重要末端分子，Gli1／2 转录活跃的SHH 型MB 患者往往预后不佳。研究发现，对Gli1／2 进行拮抗可抑制MB 细胞增殖[17]。二甲双胍可通过激活AMPK 而直接和间接抑制Gli1 的转录活性，从而下调SHH 信号通路的下游CyclinD1、Caspase-3 和Caspase-9 等与细胞增殖、凋亡相关基因的表达。Li 等[18]发现，在MB 中，AMPK 可以磷酸化Gli1蛋白的第102 号、408 号丝氨酸残基和第1074 号苏氨酸残基，降低Gli1 的稳定性和表达水平，从而阻断SHH 信号通路的转录活性，但并不降解Gli1；Di Magno 等[19]则认为AMPK 通过磷酸化Gli1 的408 号丝氨酸残基直接发挥降解Gli1 的作用。此外，AMPK 可以抑制雷帕霉素靶蛋白复合体1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）的表达。mTORC1 可磷酸化核糖体p70S6 激酶蛋白（SK61）和真核起始因子4E 结合蛋白1（4E-BP1），还可调节PI3K／Akt 和RAS-Raf-MAPK 等信号通路，促进肿瘤细胞生长[20]。研究表明mTOR 信号通路也可促进Gli1 的表达[21]，二甲双胍可通过激活AMPK 抑制mTOR 信号通路，从而间接抑制SHH 信号通路。最近Elgendy等[22]发现小鼠在禁食状态下联合使用二甲双胍可激活GSK3β从而抑制肿瘤生长。GSK3β 的激活可促进Gli 的磷酸化从而抑制SHH 信号通路的激活，或许也是二甲双胍可抑制MB 的潜在机制之一。目前细胞和动物实验已经证实二甲双胍在胰腺癌、胃癌和乳腺癌中可以显著下调PTCH1、SMO 和Gli1 等SHH 通路标志物的表达[23,24]。此外，Gonnissen 等[25]发现联合使用二甲双胍和GANT61 处理前列腺癌细胞可以更好地降低SHH 通路的激活，抑制肿瘤细胞生长并增加其对放疗的敏感性。这提示二甲双胍与其他SHH 通路靶向药联合使用存在更好的疗效。

二甲双胍还可为MB 的治疗带来其他效益。如二甲双胍可通过激活AMPK 通路磷酸化p53 蛋白的15 号丝氨酸残基从而诱导细胞周期阻滞，这或许可以改善TP53 突变的SHH 型MB 的预后。二甲双胍可以改善代谢状况、增强免疫系统激活、改善肠道微生态，从而抑制肿瘤细胞繁殖。此外，还有研究表明二甲双胍可以减轻胶质瘤引起的脑水肿，对MB 的治疗亦有积极意义[26]。

4 二甲双胍对MB 的治疗前景

二甲双胍作为治疗2 型糖尿病的降糖药问世多年，其安全性已得到广泛验证，其对于多种肿瘤的抑制作用也在细胞实验和临床研究中被证实。在SHH 信号通路中，二甲双胍作用的Gli 处于通路的末端，对其进行抑制也可解决上游PTCH1、SMO、SUFU 等基因突变造成的SHH 信号通路异常，克服MB 对现有SMO 抑制剂产生的耐药性，具有更广的适用范围。临床前研究已证实二甲双胍对SHH 通路异常的胰腺癌、胃癌和乳腺癌具有良好的疗效；与其药理作用相似的双胍类降糖药苯乙双胍在SHH 型MB 的研究中也表现出良好的效果[27]。此外，研究表明小鼠口服二甲双胍后脑组织中活化的AMPK 增多，说明二甲双胍可穿过血脑屏障发挥作用[28]。二甲双胍在MB 的治疗中具有光明的前景，有待进一步研究验证。