两种石耳科多糖的理化特性及其抗炎症作用

罗巅辉

(华侨大学 化工学院， 福建 厦门 361021)

石耳科(Umbilicariaceae)物种石耳隶属于真菌界，多生长在岩石上.石耳入药已有悠久的历史，民间常用来消肿，治疗肠炎、鼻出血和痢疾等病症.2015年，石耳正式被陕西省药材标准收录[1]，据记载，石耳无毒，具有消炎和去毒的功效[2].石耳科两个属Umbilicaria和Lasallia因其子囊盘盘面平坦光滑，二者形态极其相似，民间并没有区分使用，早年间一直被归为石耳科同属物种[3].

炎症因子的过量表达会引起多种慢性疾病，如导致脑出血患者二次脑损伤.脑出血患者发病后会释放大量的炎症因子，从而增加血脑屏障的通透性，引起脑水肿等脑出血后二次损伤[4].本文以2个不同产地石耳科物种石耳(U.esculenta)和疱脐衣(L.papulose)为研究对象，制备多糖类天然活性成分，以期从理化特性、微观结构和抗炎症作用方面对石耳科形态难以区分的两个物种进行深入对比，并为炎症因子过表达引起的相关慢性疾病药物的开发提供方向.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

两个原材料分别购自重庆市城口县巴山物语农业发展有限公司和江西省宜春市志东贸易销售商行，由华侨大学生物系教研组通过形貌鉴定，并基于ITS序列的聚类分析[5]，确定其分别隶属于石耳科石耳属常见种U.esculenta和疱脐衣属物种L.papulosa.

单糖标准品、葡聚糖标准品和脂多糖(美国Sigma公司)；胎牛血清(德国PAN-Biotech公司)；DEAE-Segharose CL-6B型层析介质(瑞士Pharmacia公司)；反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(美国普洛麦格公司)；其他试剂均为分析纯.

CKX41型倒置显微镜(日本Olympus公司)；HP1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；4800II型实时荧光定量PCR系统(瑞士Roche公司)；H-7650型透射电子显微镜(日本Hitachi High-Technologies公司)；Forma 3111型二氧化碳培养箱、Nicolet Nexus 470型红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司).

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的制备 将干燥的原材料粉碎，在料液比(g∶mL)为1∶30，提取温度90 ℃，提取时间2 h的条件下，提取得到多糖粗提液.将所得粗提液过滤，用旋转蒸发仪浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇，获得沉淀.将沉淀溶解后进行反复冻融，使用Sevag法脱蛋白，冷冻干燥后得到粗多糖[6]，分别命名为CUE和YUF.

取300 mg上述粗多糖溶于20 mL蒸馏水中，上样于DEAE-Sepharose CL-6B型层析柱.首先，用蒸馏水洗脱(流速为1 mL·min-1，每12 min收集1管)，再进行直线梯度洗脱(0～1 mol·L-1NaCl各600 mL)，采用苯酚-硫酸法在波长490 nm下检测糖分布[7].从U.esculenta和L.papulosa中分别收集到1种纯化多糖，经过浓缩、冷冻干燥后，分别命名为CUEP和YUFP.

1.2.2 单一性和分子质量鉴定 采用高效体积排阻色谱(HPSEC)法，使用SUGAR KS-804型色谱柱(柱温为50 ℃)和示差折光检测器，鉴定上述纯化多糖的单一性.将超纯水作为流动相(1 mL·min-1)，根据各葡聚糖标准品的出峰时间，制作分子质量标准曲线，从而分析各多糖的分子质量[8].为了检测样品的纯度，取1 mg·mL-1纯化多糖样品液在190～800 nm下进行紫外光谱扫描，鉴定样品是否含有核酸及蛋白类物质.

1.2.3 成分分析 采用苯酚-硫酸法测定糖含量(质量分数)；取2 mg样品进行KBr压片后，使用Nicolet Nexus 470型红外光谱仪测定纯化产物的特征官能团[7].

1.2.4 单糖组成和微观结构研究 取30 mg样品溶于4 mL 1 mol·L-1硫酸中，100 ℃烘箱水解8 h，反应液用碳酸钡中和、离心后，取上清液冷冻干燥得水解产物.取1 mg·mL-1水解产物经0.22 μm尼龙膜过滤后，进行高效液相色谱分析(使用SUGAR SP0810型色谱柱，超纯水作为流动相，流速为0.5 mL·min-1，柱温为85 ℃，采用示差折光检测器检测[9]).

将1 mg·mL-1纯化多糖样品液与1 mg·mL-1的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液等体积混合，80 ℃温浴后，稀释到适当倍数，取1滴稀释液滴加到碳支持膜(200目)上，干燥5 h后，使用透射电子显微镜观察微观结构[9-10].

1.2.5 多糖的抗炎症作用 将RAW264.7细胞置于DMEM完全培养基中培养48 h后进行传代，炎症模型的建立通过1 μg·mL-1脂多糖(LPS)诱导完成，设置空白组、阴性对照组、阳性对照组和样品组进行抗炎症实验研究.细胞在6孔板中培养24 h后，阳性对照组更换2 mL含75 μg·mL-1地塞米松(DXMS)的完全培养基，样品组更换2 mL含75 μg·mL-1纯化多糖样品的完全培养基，继续培养，20 h后分别在阴性对照组、阳性对照组和样品组中添加1 μg·mL-1LPS后，继续培养4 h[11].提取各组细胞内的总RNA，进行cDNA的反转录及实时荧光定量PCR(qPCR)检测.qPCR扩增共进行45个循环，扩增条件是95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，使用相对定量方法(2-ΔΔCT法)计算TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2 的mRNA相对表达量[11-12].

2 实验结果与分析

2.1 CUEP和YUFP的制备

使用热水提取和无水乙醇沉淀后，从两种原材料中提取得到粗多糖CUE和YUF，提取率分别为15.91%，9.30%.CUE和YUF经冻融和脱蛋白后进行柱层析纯化，得到糖分布曲线，如图1所示.图1中：D490为波长490 nm下的吸光值.根据糖分布情况，按照糖主峰收集洗脱液，洗脱液经透析袋(截留相对分子质量3 500)透析后，得到纯化样品CUEP和YUFP，得率分别为25%和27%.

(a) CUE (b) YUF

2.2 CUEP和YUFP的成分分析

CUEP和YUFP的单一性鉴定结果，如图2所示.图2中：t为保留时间.由图2可知：CUEP由分子质量为162～474 u的多糖链聚合而成，而YUFP单一性较好，由分子质量为98 u的单一成分组成.

(a) CUEP (b) YUFP

根据葡萄糖标准曲线y=0.017 4x+0.011 45(R2=0.999)，CUEP和YUFP的糖含量(质量分数)分别为(97.00±3.03)%和(97.00±1.72)%.紫外光谱扫描结果显示，CUEP和YUFP均不含有蛋白质和核酸.

利用FTIR检测CUEP和YUFP的特征官能团，其红外光谱图如图3所示.图3中：σ为波数.由图3可知：CUEP和YUFP在3 410 cm-1处出现的吸收峰是由-OH伸缩振动引起，2 900 cm-1附近的弱峰是由C-H伸缩振动产生，1 640 cm-1附近的吸收峰是由C=O基引起，而1 050 cm-1处的吸收峰则是由C-O-C振动吸收产生的.这4处的吸收峰为糖类物质的特征官能团吸收峰，说明CUEP和YUFP均为糖类物质[13].

图3 CUEP和YUFP的红外光谱图

使用硫酸将多糖CUEP和YUFP完全水解为单糖，对水解产物进行高效液相色谱分析，从而确定多糖的单糖组分.CUEP和YUFP的高效液相色谱图，如图4所示.参照标准图谱[9]可知，CUEP和YUFP均由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖组成，其摩尔比分别为177.96∶1.00∶4.45∶3.19和33.21∶3.17∶1.00∶2.40.两种多糖主要由葡萄糖组成，但CUEP所含的葡萄糖比例是YUFP的5倍以上.

(a) CUEP (b) YUFP

CUEP和YUFP的透射电镜图，如图5所示.由图5可知：CUEP是由长短不一的线状结构组成，各单链之间高度聚集，彼此相互缠绕在一起；YUFP同样由多股链聚合组成，但形状相对规则，各单链之间相互缠绕组成一个个小的蝴蝶结状结构.相比之下，CUEP链长且缠绕聚集度高，在相同质量浓度的SDS溶液中更不容易解聚分散.

(a) CUEP (b) YUFP

2.3 抗炎症作用

首先，判断CUEP和YUFP对RAW264.7细胞的细胞毒性，以确保后续抗炎症实验是在无细胞毒状态下进行的.细胞毒性实验结果表明：当CUEP或YUFP添加剂量为75 μg·mL-1时，RAW264.7细胞生长状态良好，说明该剂量下无细胞毒性.

CUEP和YUFP对RAW264.7细胞炎症因子mRNA相对表达量的影响，如图6所示.图6中：*表示P<0.05；**表示P<0.000 1.由图6可知：与空白组相比，添加LPS可显著增加阴性对照组中炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6，COX-2的mRNA相对表达量(P<0.000 1)，说明炎症模型已成功构建.

由图6(b)可知：与阴性对照组相比，阳性对照组显著降低了LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-1β的mRNA相对表达量(P<0.05)，抑制率为61.60%；添加75 μg·mL-1CUEP或YUFP的样品组均能显著降低IL-1β(P<0.000 1)的mRNA相对表达量，抑制率分别为60.58%和88.12%，其中，YUFP样品组的抑制效果显著优于阳性对照组(P<0.000 1).由图6(c)可知：阳性对照组和CUEP样品组均能显著降低炎症因子IL-6的mRNA相对表达量(P<0.05)，抑制率分别为76.80%和66.62%，而YUFP样品组无显著抑制效果.由图6(d)可知：阳性对照组和CUEP样品组中COX-2的mRNA相对表达量显著降低(P<0.000 1)，抑制率分别为83.90%和66.92%.

(a) TNF-α (b) IL-1β

综上所述，YUFP对炎症因子IL-1β的抑制效果显著优于阳性对照组，CUEP对IL-1β，IL-6，COX-2的抑制效果与阳性对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，其综合抗炎症作用更好.

3 结论

从石耳科两个相近物种U.esculenta和L.papulosa中分离纯化得到多糖CUEP和YUFP.CUEP是由分子质量为162～474 u的多糖链聚合而成，YUFP则由分子质量为98 u的单一多糖组成.二者的单糖组成均为葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖，但CUEP所含葡萄糖比例明显高于YUFP.CUEP和YUFP具有不同的微观结构，CUEP呈线状，而YUFP呈蝴蝶结状，CUEP聚合度更高更不易解聚.质量浓度为75 μg·mL-1的CUEP和YUFP对RAW264.7细胞无毒，且能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2的mRNA相对表达量，CUEP综合效果好，而YUFP则主要能显著降低IL-1β的mRNA相对表达量，且优于地塞米松的抑制效果(P<0.000 1).

U.esculenta和L.papulosa外貌形态极其相似，不易区分，但其主要的多糖类物质在分子质量、单糖组成和微观结构上均有差异，这些特征使它们的生物活性显著不同[14].分子质量高、葡萄糖占比高和螺旋程度高的CUEP能更好地抑制炎症因子的过表达.多糖的微观结构对其生物活性影响较大，螺旋缠绕结构的多糖可能具有更好的生物活性[15-16].CUEP相对螺旋缠绕程度更高更不易解聚，这可能与其拥有更好的抗炎症因子过表达能力相关联.炎症因子的过量表达与很多慢性疾病相关，如炎性因子IL-1β能引起脑水肿，该炎症因子在脑出血急性期会大量表达，是脑出血后炎性反应的重要标志[4].从上述研究结果看，石耳科多糖能有效抑制炎症细胞中IL-1β的过量表达，且多糖没有毒副作用，其有效成分结构明确，可用于辅助治疗炎症因子过表达引起的相关慢性病，尤其可作为脑出血患者预防二次脑损伤的辅助药物.