口腔鳞癌患者PLK1、caspase-3及Ki-67变化及临床意义

赵亭亭 刘振丽 李立恒 张璇 李超 马赛★

口腔鳞状细胞癌发病率较高，占头颈部恶性肿瘤的40%，90%以上的口腔鳞状细胞癌患者为口腔粘膜原发性恶性肿瘤［1-2］。由于目前临床对口腔鳞状细胞癌发生及病程中相关分子机制的认识尚欠深入研究，临床漏诊、误诊率较高。提高口腔鳞状细胞癌的早期诊断率，是保障治疗效果、延长患者生存期的重要手段。保罗样激酶1（Polo-Like Kinase1，PLK1）主要存在于真核细胞中，其活性增加可促进细胞增殖，与胃癌、结肠癌、口腔癌等恶性肿瘤关系密切［3］。凋亡同胱氨酸蛋白-3（Cysteinyl Aspartate-specific Proteninases-3，Caspase-3）是细胞凋亡的中心环节，有研究显示，Caspase-3 在口腔鳞状细胞癌患者中阳性表达率较高，其在癌细胞的发生、发展中占有重要地位［4］。细胞增殖核抗原（nuclear-associated antigen，Ki-67）是增殖细胞中存在的标志性抗原，Ki-67 水平可反映细胞增殖活性，在多种恶性肿瘤中均存在Ki-67 过度表达［5］。本研究旨在分析口腔鳞状细胞癌患者PLK1、caspase-3、Ki-67 变化及临床意义，并探讨三者与口腔鳞状细胞癌患者预后的关系，以期为评估口腔鳞状细胞癌病情进展及预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2019年3月河北北方学院附属第一医院收治的口腔鳞状细胞癌患者的临床资料。纳入标准：①所有患者均穿刺活检证实为口腔鳞状细胞癌［6］；②影像资料、临床资料及随访资料完整；③纳入研究前未进行过放、化疗治疗。排除标准：①合并肝、肾等重要器官严重疾病或恶性肿瘤者；②阿尔兹海默症者、精神障碍者。最终纳入104 例患者，选取上述患者口腔黏膜鳞状细胞癌标本做为癌组织组，选取远离癌组织3 cm 的癌旁组织作为癌旁组织组。其中男68例，女36 例；平均年龄（52.14±3.32）岁。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属已签署知情同意书。

1.2 指标检测方法

采用SP 免疫组化染色检测PLK1、caspase-3、Ki-67 在癌组织及癌旁正常组织中的表达情况。每例组织蜡块均切片4 张，厚度约4 μm，标本均经甲醛溶液固定，石蜡包埋，载玻片泡酸，DAB 显色剂显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。于镜下观察PLK1、caspase-3 及Ki-67。PLK1、caspase-3 及Ki-67 兔多克隆抗体均由美国Epitomics 公司提供。

1.3 阳性判断标准

PLK1、caspase-3 及Ki-67 阳性判定标准：细胞胞质或细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒，反之则为阴性［7］。阳性细胞比例评分：≤5%为0 分，＞5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分；染色强度评分：未染色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。染色指数=阳性细胞比例评分＋染色强度评分。将以上两项评价结果相加，总得分＜2 分为阴性，总得分≥2 分为阳性。

1.4 随访

对104 例患者随访两年（以电话随访为主，门诊为辅），记录两组患者2年死亡率，随访时间截止至2021年3年。

1.5 统计学方法

使用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计数资料通过n（%）表示，并采用χ2检验；计量资料通过（）表示；采用受试者工作特征曲线（ROC）评估诊断价值，计算曲线下面积（AUC）；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLK1、caspase-3 及Ki-67 在不同组织中的表达

癌组织组PLK1、caspase-3 及Ki-67 阳性表达率均明显高于癌旁组织组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 PLK1、caspase-3 及Ki-67 在不同组织中的表达［n（%）］Table 1 Expression of PLK1，Caspase-3 and Ki-67 in different tissues［n（%）］

图1 免疫组化染色图（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemical staining（SP，×400）

2.2 不同预后的患者PLK1、caspase-3及Ki-67表达

本研究随访率100%，随访期间死亡63 例（60.58%），生存41 例（39.42%）。PLK1、caspase-3及Ki-67 阳性表达的患者死亡率显著高于PLK1、caspase-3 及Ki-67 阴性表达的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同预后的患者PLK1、caspase-3 及Ki-67 表达［n（%）］Table 2 Expression of PLK1，Caspase-3 and Ki-67 in patients with different prognosis［n（%）］

2.3 影响口腔鳞状细胞癌患者预后生存的单因素和多因素分析

临床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴结转移、分化程度中-低分化、单一手术治、治疗依从性佳、PLK1（阳性）、caspase-3（阳性）及Ki-67（阳性）为影响口腔鳞状细胞癌患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响口腔鳞状细胞癌患者预后生存的单因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of prognostic survival in patients with oral squamous cell carcinoma

2.4 联合三者对口腔鳞状细胞癌患者预后死亡的预测价值

三项指标（PLK1+caspase-3+Ki-67）联合检测灵敏度（0.924）、特异度（0.947）、AUC（0.969）均高于单一指标检测（P＜0.05）。见表4、图2。

图2 ROC 曲线图Figure 2 ROC curve

表4 联合三者对口腔鳞状细胞癌患者预后死亡的预测价值Table 4 The predictive value of the combination of the three for the prognosis and death of patients with oral squamous cell carcinoma

3 讨论

口腔鳞状细胞癌的发生是一个多步骤的过程，在癌细胞增殖的过程中，由多种蛋白共同参与，为肿瘤组织生长提供营养物质及氧气，增强癌细胞的迁移及侵袭能力［8］。寻找口腔鳞状细胞癌发生、发展中的关键蛋白，是防治口腔鳞状细胞癌生长及增殖的重点。

PLK1 为PLK 家族中的成员之一，PLK1 在哺乳动物细胞有丝分裂过程中占有重要地位，研究显示PLK1 在分裂活跃的组织器官及肿瘤细胞中活性较高［9-10］。caspase-3 是一种半胱氨酸蛋白酶，在正常组织中caspase-3 以无活性的酶前体存在于细胞内，不具备生物功能，在癌细胞中caspase-3 酶原可被激活，参与细胞凋亡，损伤正常细胞［11］。Ki-67可标记增殖性细胞核，敏感地反映恶性肿瘤的增殖率及侵袭力，对肿瘤的诊断、预后评估有重要指导意义［12］。本研究中，癌组织组PLK1、caspase-3及Ki-67 阳性表达率均明显高于癌旁组织组，提示，在口腔鳞状细胞癌的发生过程中，PLK1、caspase-3 及Ki-67 可能起着至为关键的作用，可作为诊断、评估口腔鳞状细胞癌病情的潜在有效指标。有学者研究指出，PLK1 在细胞有丝分裂的不同时期均起到十分重要的作用，其通过细胞外基质参与肿瘤的侵袭及转移，与恶性肿瘤疾病患者预后关系密切［13］。相关文献报道，caspase-3 是细胞凋亡的关键执行者，caspase-3 的出现或升高代表着细胞发生不同程度的死亡，高活跃度的caspase-3对ADP-核糖聚合酶、肌动蛋白以及固醇调节元件蛋白有聚集功能，在相互作用下导致细胞走向凋亡［14］。相关研究发现，Ki-67 能较为全面地反映细胞增殖数量，Ki-67 阳性表达升高往往提示病情恶性程度增加，Ki-67 的增殖活性是判断乳腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤患者预后的重要因素之一［15］。本研究随访率100% ，随访期间死亡63 例（60.58%），生存41 例（39.42%）。随访结果显示临床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴结转移、分化程度中-低分化、PLK1（阳性）、caspase-3（阳性）及Ki-67（阳性）为影响口腔鳞状细胞癌患者预后生存的独立危险因素。结果提示，PLK1、caspase-3 及Ki-67 阳性率高，患者病情会随之加重，淋巴结转移的危险性也会显著增加，三项指标均与患者病情进展相关。

ROC 曲线结果显示，三项指标（PLK1+caspase-3+Ki-67）联合检测灵敏度（0.924）、特异度（0.947）、AUC（0.969）均高于单一指标检测。由此可以推测，联合PLK1、caspase-3 及Ki-67 检测能作为预测口腔鳞状细胞癌预后死亡的一种有效手段。

综上所述，PLK1、caspase-3 及Ki-67 参与口腔鳞状细胞癌发生的过程，且与患者预后密切相关，临床可加强联合三项指标检测，提高口腔鳞状细胞癌早期诊断率，以评估患者预后，为针对PLK1、caspase-3 及Ki-67 开展分子靶向治疗提供新方向。