肠道病毒EV71型和CA16型IgM抗体检测试剂盒的分析性能

何水珍 严荔贞 施少鑫 钟秋蓉

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种由病毒引起的传染性疾病，5 岁以下儿童为常见患者［1］。肠道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16 型（Coxsackievirus A16，CA16）是手足口病最常见的致病病原体，其中EV71 是重症和致命病例中最常见的致病病原体［2］。从20世纪90年代开始，EV71 在亚洲地区及太平洋沿岸地区已经导致了数千人死亡［3］，2008-2017年，全国手足口病总报告发病率为134.59/10 万［4］。手足口病不仅对婴幼儿的健康造成了极大的伤害，而且造成的疾病负担尤为严重［5］，已纳入我国法定传染病丙类管理［6］。IgM特异性抗体是感染初次体液免疫应答中最早出现的抗体，可作为感染的早期诊断指标。根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会《手足口病诊疗指南（2018年版）》诊断建议：在临床诊断病例基础上，急性期血清相关病毒IgM 抗体阳性可定为确诊病例［1］。早期开展CA16 IgM 和EV71 IgM 抗体的联合检测，可以为手足口病的诊断及监控治疗，提供切实支撑［7］，因此，EV71 IgM和CA16 IgM 的检测具有重要的临床应用价值。本研究对基于化学发光法检测肠道病毒71 型IgM 抗体的试剂盒和检测柯萨奇病毒A16 型IgM抗体的试剂盒进行分析性能评价，并探讨其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

全自动化学发光免疫分析仪Caris200（厦门优迈科医学仪器有限公司）；DEM-3 型洗板机（北京拓普分析仪器有限公司）；电热恒温标准水箱ZD-600（杭州蓝天仪器有限公司）；酶标仪Sunrise（Tecan Austria GmBH）；厦门万泰凯瑞生物技术有限公司研制的肠道病毒71 型IgM 抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）（EV71 IgM CMIA）和柯萨奇病毒A16 型IgM 抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）（CA16 IgM CMIA）；北京万泰生物药业股份有限公司生产的肠道病毒71 型IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）和柯萨奇病毒A16 型IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）。

1.2 方法

1.2.1 分析性能评价

1.2.1.1 精密度评价 参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关文件［8］，连续测定重复性参考品CV1 和CV2 各10 次，计算变异系数（coefficient of variation，CV），以此作为批内精密度。将两批试剂每天在不同仪器上重复检测一份强阳样本（P1）、中阳样本（P2）、弱阳样本（P3）及一份阴性样本（N1）两次，连续检测20 d，综合日间、台间、批间等影响变量，计算CV，以此作为中间精密度。

1.2.1.2 机载稳定性评价 将试剂放置于仪器上，分别在开瓶的第1 天、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天检测3 例阳性样本，通过比对与第0 天发光强度比值，评估试剂的机载稳定性。

1.2.1.3 交叉反应试验 收集临床病症与手足口病相似或者病原结构与肠道病毒相近的其他病原体，如：弓形虫IgM（Tox IgM）、甲流IgM（FluA IgM）、乙流IgM（FluB IgM）、人类副流感病毒IgM（HPIVs IgM）、风疹病毒IgM（RV IgM）、嗜肺军团菌IgM（LP IgM）、巨细胞病毒IgM（CMV IgM）、单纯疱疹病毒I 型IgM（HSV-I IgM）、单纯疱疹病毒Ⅱ型IgM（HSV-ⅡIgM）、合胞病毒IgM（RSV IgM）、肺炎支原体IgM（MP IgM）、肺炎衣原体IgM（CP IgM）、EB 病毒IgM（EBv IgM）的高浓度特异性抗体血清样本，使用CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 进行检测。

1.2.1.4 方法学比对 选择经柯萨奇病毒A16 型IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）检测为CA16 IgM 阳性的样本153 例，以及438 例CA16 IgM 为阴性的健康体检人群样本，用CA16 IgM CMIA 进行检测，获得相应样本检测的相对发光值（Relative luminous value，RLU）。对阳性样本和阴性样本检测RLU 值进行ROC 曲线分析，并计算与已上市酶免试剂的符合率。

选择经肠道病毒71 型IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫法）检测为EV71 IgM 阳性的样本154例以及500 例EV71 IgM 为阴性的健康体检人群样本，用EV71 IgM CMIA 进行检测，获得相应样本检测的RLU。对阳性样本和阴性样本检测RLU值进行ROC 曲线分析，并计算与已上市酶免试剂的符合率。

1.2.2 统计学方法

采用WPS Office Excel 及Prism8 软件进行统计分析；计数资料以n或%表示；对样本检测RLU用Prism8 进行ROC 曲线绘制。

2 结果

2.1 试剂精密度

CA16 IgM CMIA 测定重复性参考品的批内精密度CV 分别为1.10%和1.63%，检测强、中、弱阳样本和阴性样本的中间精密度CV 为5.70%～7.20%；EV71 IgM CMIA 测定重复性参考品的批内精密度CV 分别为2.80%和1.59%，检测强、中、弱阳样本和阴性样本的中间精密度CV 为2.91%～4.49%。见表1、表2。

表1 批内精密度实验结果（n=10）Table 1 Test results of intra-assay precision（n=10）

表2 中间精密度实验结果（n=40）Table 2 Test results of intermediate precision（n=40）

2.2 试剂机载稳定性

试剂机载稳定性研究结果显示，CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 的偏差均小于±10%。见表3。

表3 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 机载稳定性评价（偏差）Table 3 On-board stability evaluation of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA（deviation）

2.3 交叉反应试验

Tox IgM、FluA IgM、FluB IgM、HPIVs IgM、RV IgM、LP IgM、CMV IgM、HSV-I IgM、HSV-II IgM、RSV IgM、MP IgM、CP IgM、EBv IgM 的高浓度特异性抗体血清样本不会影响CA16 IgM CMIA和EV71 IgM CMIA 的检测结果，不存在交叉反应。见表4。

表4 高浓度的其它病原体抗体血清交叉反应结果Table 4 Results of cross reaction with high concentration antibody serum of other pathogens

2.4 方法学比对

以柯萨奇病毒A16 IgM 型检测试剂盒（酶联免疫吸附法）判定结果，用CA16 IgM CMIA 对阳性样本和阴性样本检测RLU 值进行ROC 曲线分析，结果显示，阳性符合率为96.1%，阴性符合率为96.6%。见表5。ROC 曲线下面积为0.9908，以RLU为243907 作为Cut-off 值，特异性为96.60%，灵敏度为96.08%。见图1a。

表5 CA16 IgM CMIA 阴阳符合率Table 5 Positive and negative coincidence rate of CA16 IgM CMIA

以肠道病毒71 型IgM 抗体检测试剂盒（酶联免疫吸附法）判定结果，用EV71 IgM CMIA 对阳性样本和阴性样本检测RLU 值进行ROC 曲线分析，结果显示，阳性符合率为100%，阴性符合率为98.5%。见表6。ROC 曲线下面积为0.9993，以RLU 为79533 作为Cut-off 值，特异性为100.00%，灵敏度为98.53%。见图1。

表6 EV71 IgM CMIA 阴阳符合率Table 6 Positive and negative coincidence rate of EV71 IgM CMIA

图1 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA ROC 曲线Figure 1 Receiver operating characteristic curve of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA

3 讨论

肠道病毒的早期诊断对后期疾病的防治工作意义重大。尽早明确患者感染类型对于手足口病的诊断分型进而采取最佳预防措施至关重要，其可有效地控制手足口病的传播及暴发［9］。目前，主要的诊断方式有RNA 检测［10］及IgM 抗体检测［9］。相较于价格昂贵，操作复杂的RNA 检测，IgM 抗体检测价格低廉，操作简单，具有广泛的应用价值。目前，肠道病毒EV71 IgM 抗体和CA16 IgM 抗体的检测方法主要有酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），胶体金免疫层析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）和化学发光法（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）［7，11-13］。其中，化学发光法检测操作简单，检测效率高，特异性强、灵敏度好，有助于提高临床检测效率。除此之外，由于手足口病的与大多流感、肺炎以及其他病毒引起的脑膜炎（如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB 病毒等）病症接近，从而导致误诊的情况，因此，高特异性无交叉反应的检测试剂尤为重要，它可有效避免误诊导致的治疗延后，提高诊治效益。

通过EV71 IgM 和CA16 IgM 的联合检测有助于手足口病致病原的明确，对于手足口病患儿的及时、合理治疗、预后改善有重要的指导意义。本研究基于磁微粒化学发光法的柯萨奇病毒A16 型IgM 抗体检测试剂盒和肠道病毒71 型IgM 抗体检测试剂盒具有良好性能，适应于临床诊断应用，将为手足口病的诊断及监控治疗提供切实支撑。