青蒿琥酯通过TLR4/NF-κB信号通路抑制人胃癌裸鼠移植瘤生长及对PCNA和ZNF139表达的影响Δ

刘晓蕾，马立东，张朵朵

(1.邯郸市第一医院老年病一科，河北 邯郸 056000； 2.邯郸市第一医院消化一科，河北 邯郸 056000； 3.河北省优抚医院内一科，石家庄 050062)

胃癌是我国死亡率居前3位的恶性肿瘤，极大地危害患者的生命健康。由于缺乏特殊临床表现，胃癌早期诊断率低，确诊时多为中晚期，该类患者手术治疗效果不佳，化疗敏感性低，5年生存率普遍<30%[1]。相较于西医治疗，中药可作用于胃癌发生、发展多个环节，具有多环节、多靶点的特点，同时不良反应小、耐药性低，是我国治疗恶性肿瘤的特色疗法。青蒿琥酯是中药青蒿中分离得到的抗疟疾有效单体青蒿素的衍生物，具有抗感染、抗疟、免疫调节和抗肿瘤等多种生物活性[2-3]。增殖、侵袭转移是胃癌演变过程中的重要步骤，也是造成患者预后差的主要原因，增殖细胞核抗原(PCNA)与DNA合成密切相关，在细胞增殖周期中作用关键；锌指蛋白(ZNF)家族成员对多种基因的转录调控发挥着重要作用。本实验以人胃癌裸鼠移植瘤动物模型为研究对象，分析青蒿琥酯对人胃癌裸鼠移植瘤生长及对PCNA和ZNF139表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株

SPF级BALB/c裸鼠40只，8周龄，雌雄各半，体重(22±5) g，购自广东省医学实验动物中心，动物许可证号为SCXK(粤)2019-0035。适应性饲养1周，室温20～22 ℃，通风良好，自由饮水进食，12 h明暗交替。人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞所。

1.2 仪器

CKX53型光学显微镜(日本Olympus公司)；LF-31DS型琼脂糖凝胶电泳设备(北京龙方科技有限公司)；MQ-PYZ-82型电热恒温培养箱[中科美其(北京)科技有限公司]；Fluocycle型荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(上海科华生物工程股份有限公司)。

1.3 药品与试剂

注射用青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司，国药准字H10930195，规格为60 mg)；注射用顺铂(齐鲁制药有限公司，国药准字H37021358，规格为10 mg)；氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司，国药准字H20083400，规格为500 mL∶4.5 g)；10%胎牛血清(FBS，澳大利亚Ausbian公司，货号为VS100TZ)；RPMI 1640培养基(美国Thermo Fisher公司，批号为187256)；Trizol Reagent(美国Invitrogen 公司，批号为18572)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养：人胃癌细胞株SGC7901接种于1640培养基(10%FBS)，5%CO2、37 ℃和95%湿度条件下培养，每3 d换液1次，待细胞生长汇合时按1∶ 3传代，每周1～2次。经0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液消化后收集对数生长周期细胞。

1.4.2 人胃癌裸鼠移植瘤模型建立：将收集的对数生长周期细胞按800 r/min离心(离心半径为13.5 cm)分离4 min，弃置上清液后配制为单细胞悬液(2×107个/mL)。无菌条件下接种于裸鼠腋下，剂量为0.2 mL/只，继续饲养1周观察状态。以裸鼠皮下出现直径约5 mm的结节为模型建立成功标准，40只裸鼠均建模成功，成瘤率为100%，

1.4.3 实验分组及干预方法：将40只建模成功裸鼠随机分为模型组、顺铂组、青蒿琥酯组和联合组，每组10只。顺铂组给予顺铂4 mg/kg，青蒿琥酯组给予注射用青蒿琥酯100 mg/kg，联合组给予顺铂4 mg/kg+注射用青蒿琥酯100 mg/kg，模型组给予等量0.9%氯化钠溶液。所有大鼠均瘤体内注射给药，给药体积为0.01 mL/g，每周给药2次，持续4周。

1.4.4 标本处理：停药次日称重，摘眼球取血，处死裸鼠，取瘤体，剥离中心坏死组织和周围结缔组织，分为4份，1份采用甲醛固定进行病理检测，2份以液氮快速冰冻后于-80 ℃保存待检，1份研磨成细胞悬液进行原代细胞培养。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 一般情况观察：从药物干预开始直至停药，每日观察裸鼠食欲、活动度和精神状态等情况。

1.5.2 抑瘤作用观察：取各组裸鼠瘤体称重，计算抑瘤率=(模型组瘤体平均重量-干预组瘤体平均重量)/模型组瘤体平均重量×100%。

1.5.3 病理检测：固定后肿瘤组织常规石蜡包埋切片，采用苏木精-伊红染色法观察病理状态。石蜡切片经二甲苯、无水乙醇脱水后进行苏木素染色10 min，自来水冲洗；分化液分化30 s，温水浸泡5 min，伊红染色2 min；脱水、透明后封片，由病理科医师在光学显微镜下观察切片病理情况，每张切片选取5张无重复视野图像，采用盲式阅片，依据阳性细胞比例判定。

1.5.4 噻唑蓝法(MTT)检测原代细胞生长：将新鲜瘤体组织加入适量PBS溶液匀浆，移动细胞悬液至离心管，1 000 r/min离心(离心半径为13.5 cm)5 min后弃置上清液，以PBS溶液冲洗3次，接种细胞培养至培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养；收集对数生长细胞，采用RPMI 1640培养基制成单细胞悬液，以5×104/mL浓度接种于96孔板，以实验分组进行分组，设置4个复孔，相同条件下培养48 h。完成后加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，培养4 h；吸取各孔上清液后加入二甲基亚砜200 μL，震荡15 min后采用酶标仪检测吸光度(OD)值(490 nm)，计算抑制率(IR)=(1-阳性孔均值/对照孔均值)×100%。

1.5.5 逆转录PCR检测PCNA、ZNF139、Toll样受体(TLR)4、髓样分化因子(MyD88)和核因子κB(NF-κB)的mRNA表达水平：-80 ℃条件下取肿瘤标本加入研磨器，加入Trizol试剂1 mL，冰上快速充分研磨；转移组织匀浆至EP管，静置15 min后加入氯仿200 μL，震荡充分混匀后静置15 min；4 ℃条件下以10 800 r/min离心(离心半径为13.5 cm)15 min；弃置上清液后加入75%乙醇洗涤，晾干沉淀后加入无RNA酶水溶解沉淀。取适量RNA和上样缓冲液混合后，1.5%琼脂糖凝胶电泳(40 mA，80 V)30 min，紫外透射仪下观察条带，检测RNA完整性；吸取样品1 μL，使用微量核酸蛋白检测仪检测浓度和纯度，-80 ℃保存。5 μg为总RNA模板，构建逆转录体系，合成cDNA，-20 ℃保存；以cDNA为米板，扩增目的基因。PCR反应条件为cDNA和上、下游引物1 μL，DEPC水7 μL，绿色体系10 μL。引物序列及PCR反应条件如下，(1)PCNA(326 bp)，上游引物为5′-CGTCTGG GCAGTGCGGCTC-3′，下游引物为5′-TGCTC GCCGCAGTAC TGCT-3′；94 ℃、3 min，90 ℃、30 s，55 ℃、50 s，72 ℃、45 s，35个循环，72 ℃、5 min。(2)ZNF139(482 bp)，上游引物为5′-CCGTCTGCTA GAGTGCGCATG-3′，下游引物为5′-GCTGACTCA GCGCTGACTCCG-3′；94 ℃、3 min，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、30 s，30个循环，72 ℃、5 min。(3)β-actin(540 bp)，上游引物为5′-GTCCCCGGGG AGGCTA CCA-3′，下游引物为5′-CTCCGGC TTAAAGTGGCAGCCTTCC-3′；94 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、30 s，30个循环，72 ℃、5 min。获得PCR产物后进行凝胶电泳，条件同上，以β-actin基因为内参，采用凝胶成像系统分析软件扫描灰度值分析mRNA水平。

1.5.6 蛋白质印迹法检测PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB相对蛋白表达水平：-80 ℃条件下取肿瘤标本加入RIPA裂解液，冰上充分裂解，4 ℃条件下以12 000 r/min离心(离心半径为13.5 cm)20 min；取定量上清液，采用BCA法测定蛋白浓度；总蛋白上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，每孔加入样品电泳后将凝胶转印至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭；稀释蛋白抗体(1∶ 1 000)4 ℃孵育过夜，第2日用TBST冲洗PVDF膜，每次5 min，共3次；加入二抗后室温孵育1 h，TBST冲洗，每次5 min，共3次；膜上加入ECL显示液，凝胶成像系统曝光显色，记录内参条带和目的条带灰度值，以β-actin为内参分析蛋白表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况比较

药物干预期间，各组裸鼠均未出现死亡。模型组裸鼠瘤体长势明显，进水、进食均明显减少，运动量减少，精神状态差，有嗜睡情况。顺铂组和青蒿琥酯组裸鼠肿瘤生长速度慢于模型组，食欲较好，运动量一般，精神状态和反应能力影响较小，有轻微嗜睡情况。联合组裸鼠肿瘤生长速度最低，食欲、运动、精神和反应能力未见明显影响。

2.2 病理结果比较

模型组胃癌细胞核细胞核增大、深染，可见明显的病理性核分裂象和恶性增殖，细胞量大、生长旺盛，紧密排列；与模型组比较，顺铂组胃癌细胞出现不同程度的凋亡，病理性核分裂象和恶性增殖明显减少，细胞排列分散，密度明显较低，可见明显空泡；青蒿琥酯组胃癌细胞病理性核分裂象和恶性增殖较模型组明显减少，细胞密度高于顺铂组，排列分散;联合组胃癌细胞病理性核分裂象和密度均低于顺铂组和青蒿琥酯组，见图1。

A.模型组；B.顺铂组；C.青蒿琥酯组；D.联合组A. model group; B. cisplatin group; C. artesunate group; D. combination group图1 病理结果比较Fig 1 Comparison of pathological results

2.3 移植瘤瘤重及抑瘤率比较

与模型组比较，顺铂组、青蒿琥酯组和联合组平均瘤重明显降低；与顺铂组比较，青蒿琥酯组平均瘤重升高，抑瘤率降低；联合组平均瘤重低于顺铂组和青蒿琥酯组，抑瘤率高于顺铂组和青蒿琥酯组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。

表1 四组裸鼠移植瘤瘤重及抑瘤率比较Tab 1 Comparison of tumor weight and tumor inhibition rate among four groups

图2 治疗4周后的裸鼠移植瘤瘤体Fig 3 Transplanted tumor in nude mice after 4 weeks of treatment

2.4 移植瘤细胞生长抑制率比较

培养48 h后，顺铂组、青蒿琥酯组和联合组的OD值均低于模型组；联合组的OD值低于顺铂组和青蒿琥酯组，抑制率高于顺铂组和青蒿琥酯组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 四组移植瘤细胞生长抑制率比较Tab 2 Comparison of growth inhibition rate of transplanted tumor cells among four groups

2.5 PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达水平比较

与模型组比较，顺铂组、青蒿琥酯组和联合组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达水平均明显降低；顺铂组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平低于青蒿琥酯组；联合组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达水平低于顺铂组和青蒿琥酯组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.6 PCNA、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白表达水平比较

与模型组比较，顺铂组、青蒿琥酯组和联合组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平均明显降低；顺铂组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平低于青蒿琥酯组；联合组PCNA2、ZNF139、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平低于顺铂组和青蒿琥酯组，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图3。

A.模型组；B.顺铂组；C.青蒿琥酯组；D.联合组A. model group; B. cisplatin group; C. artesunate group; D. combination group图3 蛋白电泳图Fig 3 Protein electrophoresis

3 讨论

作为世界范围内常见的恶性肿瘤，胃癌的发生发展与多种因素相关。很多胃癌患者在发现时已经错过最佳治疗时期，不适用于内镜或手术治疗，主要采取以化疗为主的综合治疗方案。对于晚期胃癌的治疗，尤其是多线治疗时可选择的药物并不多，而且不良反应大，疗效也欠佳[4]。寻找高效、低毒的药物治疗意义重大。

近年来，多种体外研究结果表明，青蒿琥酯对胃癌细胞的抑制和杀伤作用较为明显[5-6]。本研究通过建立人胃癌细胞株SGC7901裸鼠移植瘤模型，探讨青蒿琥酯对于胃癌裸鼠移植瘤生长的影响，并分析其可能的作用机制。研究结果显示，经过青蒿琥酯干预的裸鼠瘤重明显减轻，抑瘤率和移植瘤细胞生长抑制率均明显提高，虽然效果不及顺铂，但也能证实青蒿琥酯可抑制裸鼠移植瘤生长。通过青蒿琥酯与顺铂联合应用发现，相较于顺铂单独用药，联合用药能够更好地抑制肿瘤生长。

TLR是一类天然免疫受体家族，能特异性地识别病原相关的分析模式，在激活天然免疫的同时能够调节获得性免疫，被认为是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，其相关的信号通路在免疫调节和炎症中具有重要的作用[7-8]。相关研究结果证实，TLR4/NF-κB通路相关分子在胃癌组织中的表达与胃癌恶性行为显著相关，猜测该通路是促进胃癌发生发展的重要机制[9]。MyD88在TLR信号转导通路中起着至关重要的信号转导作用，其在胃癌组织中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。TLR4能通过MyD88激活下游的NF-κB调节血管内皮生长因子以及IL-8等炎症因子的表达，参与炎症反应、细胞增殖和凋亡等过程的调控。本研究中，青蒿琥酯组裸鼠TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平均低于模型组，证实青蒿琥酯能够抑制TLR4/NF-κB通路激活。在干预的三组中，联合组TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和相对蛋白表达水平最低，提示青蒿琥酯能够增强化疗药的效果，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路激活有关，是治疗胃癌的重要方法。

在肿瘤侵袭转移过程中，多种基因发挥着调控的作用，ZNF家族与肿瘤的侵袭、转移具有密切的关系[10-11]。相关研究结果证实，ZNF139在胃癌组织高表达，推测其参与胃癌的发生、发展及胃癌多药耐药的调控[12-13]。赵群等[14]的研究结果显示，胃癌转移过程中ZNF139促进MMP-2、MMP-7的表达，使得肿瘤细胞具有更强的侵袭能力。李振兴[15]将重组质粒siRNA-ZNF139转染至胃癌移植瘤裸鼠肿瘤中，阻断其表达后发现肿瘤细胞增殖受到明显的抑制，说明ZNF139在肿瘤增殖中的地位十分重要。本研究结果显示，经过药物干预，肿瘤组织中的ZNF139表达明显降低，证实通过药物干预能够降低肿瘤组织中ZNF的表达，从而抑制肿瘤增殖，减缓肿瘤生长速度。作为影响肿瘤进展速度的重要因素之一，细胞增殖的无限性是恶性肿瘤的重要特征[16-17]。PCNA存在于细胞核内，蛋白质相对分子质量为3.6×104，与细胞DNA合成密切相关，且表达水平与DNA合成量变化呈现一致性[18]。测定细胞内PCNA水平可反映细胞增殖的水平，可作为评价细胞生长的重要指标[19]。有研究结果证实，PCNA在癌旁组织中表达较低，而在恶性肿瘤组织内具有高表达[20]。本研究结果显示，与模型组比较，各干预组PCNA mRNA水平明显降低，提示青蒿琥酯可以抑制PCNA基因表达，从而抑制肿瘤细胞DNA合成，影响肿瘤的生长。从联合组PCNA mRNA水平显著低于青蒿琥酯组(P<0.05)也可以看出，青蒿琥酯与顺铂联合应用具有协同趋势。

综上所述，青蒿琥酯可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路激活抑制人胃癌肿瘤细胞的生长，同时能下调PCNA和ZNF139的表达，影响肿瘤增殖、侵袭和转移。