一种用于次氯酸根检测的螺二芴类双光子荧光探针的合成及性能研究

章鹏廷，秦东升，闫守财，刘页申，肖海波

（上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234）

0 引言

在水处理过程中，消毒是保证水质安全的一个极其重要的环节.天然水体经过相关的水处理工艺及消毒处理后才可以成为饮用水，污水经过相应的水处理工艺及消毒处理后才能循环利用.在众多消毒方法中，处理效率高、费用较低、操作方便的氯化消毒法仍然是目前城市饮用水和污水处理中普遍采用的消毒方式.因此，众多水体中不可避免地会残留一定量的次氯酸（HClO）.研究表明：高浓度的HClO溶液易与水中有机物反应生成氯仿、四氯化碳等致癌物质，而且HClO溶液刺激性强，会伤害呼吸系统，引起眼睛或鼻子过敏，对人体健康存在着潜在危害［1-2］.内源性HClO是一种重要的活性氧（ROS）物种，在生物体内具有重要的生理功能，参与众多生理过程，尤其是在免疫系统抵制外侵的细菌中起着极其重要的作用.然而，由于HClO的高反应性和扩散性，使它在吞噬细胞时会不受控制的产生，与多种人类疾病的产生有着密切的联系.如果生命体内的HClO含量不能维持在正常的生理水平范围内，将会破坏宿主组织，引起一系列的疾病，如：炎症性疾病、神经衰弱、肾脏疾病、心血管疾病和某些癌症等［3-4］.

随着研究技术的不断发展，荧光探针已经成为环境分析和生物检测必不可少的研究工具，结合显微技术可以实时并直观地检测和监控被测物含量水平.近些年来，检测HClO与次氯酸根（ClO-）的荧光探针发展很快，都是基于HClO的强氧化特性.2016年，TIAN等［5］报道了以花菁为荧光母体、苯硫醚为检测基团的HClO荧光探针.2018年，ZHANG等［6］报道了以荧光素为母体、对苯氨基醚为检测基团的荧光探针，可以很好地识别内源性HClO.2020年，WANG等［7］报道了以四苯乙烯为荧光母体、烯基嘧啶酮为检测基团的HClO荧光探针，并将其应用于生物体内HClO的识别.

单光子荧光探针能对一些化合物进行有效的检测，但有以下缺点：由于单光子激发波长处于紫外可见光区，光漂白、光损伤较大；生物组织自发荧光物质的激发波长也在350～560 nm，采用单光子激发会有背景干扰，影响检测的效果与精准度.而双光子荧光材料激发波长一般在700～900 nm，能有效地避免紫外光损伤和细胞组织自发荧光的干扰，不发生光漂白和光毒化，并能进行生物细胞的深层成像；同时，双光子荧光激发的荧光强度是入射光强度的二次方，荧光激发只发生在聚集点，能实现局域检测［8-11］.由于螺二芴分子的刚性三维结构和易修饰的特点，可以通过在螺二芴的不同活性位点连接探测受体和发光团.本课题组创新设计合成了一系列具有不同检测功能和高荧光量子产率的螺二芴类双光子荧光探针［12-18］，以典型的ROS物种ClO-为检测目标物，充分利用了螺二芴型双光子荧光探针优越的光化学性能，构建了一种新型的双光子荧光探针（SPF），如图1所示，对于ClO-的检测具有潜在的应用价值.

图1 目标化合物SPF的合成路线

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：显微熔点测定仪（XT4A，控温型，北京市科仪电光仪器厂）；核磁共振仪（Bruker AVANCEIII 400 MHz，德国Bruker）；紫外分光光度计（ZF-1型，上海顾村电光仪器厂）；荧光光谱仪（Cray Eclipse 500，美国瓦里安）.

主要试剂：乙酸乙酯（EA，分析纯，上海纵承化工科技有限公司）；石油醚（分析纯，上海纵承化工科技有限公司）；二氯甲烷（分析纯，上海纵承化工科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，上海纵承化工科技有限公司）；乙酸（分析纯，国药集团化学试剂公司）；二氨基马来腈（分析纯，上海迈瑞尔化学科学技术有限公司）；15%（质量分数）次氯酸钠（上海阿拉丁生化有限公司）；碳酸氢钠（分析纯，上海泰坦科技公司）；柱层析硅胶（200-300目）（分析纯，烟台江友硅胶开发有限公司）；柱层析硅胶（300～400目）（分析纯，烟台江友硅胶开发有限公司）.中间体2，7-二（4-三苯胺基）-2'，7'-二醛基-9，9'-螺二芴根据先前报道的方法制备［13］.

光谱测试条件：紫外吸收光谱测试电压350 V，狭缝宽度为0.5 nm，扫描速度为1 200 nm·min-1，四面透光比色皿（1 cm×1 cm）；荧光发射光谱测试电压350 V，狭缝宽度为10/10，扫描速度为1 200 nm·min-1，四面透光比色皿（1 cm×1 cm），激发波长为372 nm.

1.2 SPF的制备

依次称取430 mg的2，7-二（4-三苯胺基）-2'，7'-二醛基-9，9'-螺二芴和130 mg的马来腈置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL无水乙醇、10 mL EA作为溶剂，再滴加3滴催化量的乙酸.将圆底烧瓶放入80℃油浴中，搅拌回流过夜.待反应结束后，停止加热，冷却到室温.将沉降在瓶底的固体物质抽滤，滤渣用少量冷无水乙醇洗涤，滤液倒入到100 mL饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取2～3次，收集合并有机相并加入柱层析硅胶拌样，通过柱层析分离、提纯，洗脱剂体积比为V（石油醚）∶V（EA）=2∶1，烘干得到黄色固体，称重得295 mg，产率53%.1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ8.19～8.01（m，5H），7.96（d，J=7.9 Hz，1H），7.80（d，J=8.3 Hz，3H），7.63（d，J=8.3 Hz，2H），7.59～7.50（m，6H），7.46（td，J=8.0，7.2，2.7 Hz，4H），7.30（s，1H），7.28（s，2H），7.25（d，J=2.7 Hz，1H），7.15（dt，J=11.7，7.5 Hz，6H），6.92（t，J=7.3 Hz，3H），6.90～6.84（m，5H），6.83～6.76（m，5H），6.73（s，1H），6.67（d，J=8.9 Hz，1H）.13C NMR（100 MHz，Chloroform-d）δ163.7，145.9，144.8，143.3，142.4，142.0，141.1，139.9，135.2，133.1，130.5，129.6，129.1，128.9，128.8，128.5，127.2，126.8，125.7，124.7，123.2，121.1，120.2，119.2，110.1，63.5.

2 结果与讨论

2.1 光谱性能研究

把SPF分别溶解在不同极性溶剂中，并配置成物质的量浓度为1×10-5mol·L-1溶液，所使用的溶剂有：甲苯（toluenen）、1，4-二氧六环（1，4-dioxane）、二甲亚砜（DMSO）、四氢呋喃（THF）、乙酸乙酯（EA）、丙酮（acetone）、乙腈（acetonitrile）、乙醇（ethanol）.分别测定SPF在不同有机溶剂中的紫外吸收光谱（图2）和荧光吸收光谱（图3）.由图2和图3可以观察到溶剂极性对SPF的光谱性质有较明显的影响.随着溶剂的极性增强，化合物SPF的紫外吸收光谱发生了微弱的红移，而荧光光谱发生了较大的红移.在相同测试条件下，加入ClO-前后SPF的荧光强度变化在丙酮溶剂中最大，如图3所示.从图4可以发现，在丙酮水溶液体系中，随着水的比例逐渐增大，加入ClO-前后SPF的荧光增强幅度逐渐下降，由此选择V（丙酮）∶V（水）=9∶1作为后续测试的溶剂体系.

图2 SPF在不同溶剂中的紫外吸收光谱图

图3 SPF在不同溶剂中的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

图4 SPF在丙酮与水不同体积比中的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

2.2 SPF对ClO-探测性能的研究

2.2.1 SPF紫外和荧光光谱对ClO-的响应

为了探究在自然和生理条件下ClO-对化合物SPF紫外和荧光光谱的影响，向一定物质的量浓度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1，V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中加入相同物质的量浓度（1×10-5mol·L-1）的ClO-，待其反应完毕后进行紫外和荧光光谱测试.从图5可以看出，加入ClO-前后探针SPF的紫外可见吸收图中波形发生明显变化，并在350 nm处出现了等位点，说明有新的物种出现.图6显示加入ClO-后探针SPF的荧光强度明显增强.从图7可以看到，将ClO-加入到SPF溶液，溶液颜色由黄色褪为无色；在365 nm的紫外灯下，荧光显著增亮，表明SPF可以作为裸眼识别ClO-的探针.

图5 SPF在加入相同物质的量浓度的ClO-（反应时间为60 s）前后的紫外可见吸收图

图6 SPF在加入10 μmol·L-1 ClO-（反应时间为60 s）前后的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

图7 SPF在加入相同物质的量浓度的ClO-

2.2.2 SPF荧光光谱对不同金属离子和阴离子的响应

为了探究自然和生理条件下常见的金属离子对化合物SPF荧光的影响，向一定物质的量浓度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1，V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中分别加入物质的量浓度相同（1×10-5mol·L-1）的不同金属离子，包括钠离子（Na+）、钾离子（K+）、铜离子（Cu2+）、银离子（Ag+）、镁离子（Mg2+）、钡离子（Ba2+）、三价铁离子（Fe3+）、镍离子（Ni2+）、锂离子（Li+）和钴离子（Co2+）离子，待其反应完毕后进行荧光光谱测试.从图8可以看出，向SPF溶液中分别加入不同的金属离子后，荧光强度几乎没有变化，但加入ClO-后，荧光强度明显增强，表明SPF对其他金属离子没有响应，对ClO-有特异性识别作用.

图8 SPF在加入相同物质的量浓度的不同金属阳离子后的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

探究了常见的阴离子对化合物SPF荧光光谱的影响，向物质的量浓度为1×10-5mol·L-1的SPF溶液（V（丙酮）∶V（水）=9∶1）中分别加入相同物质的量浓度的不同阴离子，包括硝酸根离子（NO3-）、碳酸根离子（CO32-）、碳酸氢根离子（HCO3-）、硫酸根离子（SO42-）、氯离子（Cl-）、溴离子（Br-）、磷酸根离子（PO43-）和醋酸根离子（CHCOO-），待其反应完毕后进行荧光光谱测试.从图9可以看出，分别加入不同的阴离子后，荧光强度几乎没有变化，当加入ClO-后，荧光强度明显增强，表明探针SPF对其他阴离子没有响应，而对ClO-有特异性识别作用.

图9 SPF在加入相同物质的量浓度的不同阴离子后的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

为了探究常见的干扰物对化合物SPF识别ClO-的影响，先向一定物质的量浓度的SPF溶液（1×10-5mol·L-1）中分别加入物质的量浓度相同（1×10-5mol·L-1）的不同干扰物，包括金属离子Na+，K+，Cu2+，Ag+，铝离子（Al3+），Mg2+，Ba2+，Fe3+，Ni+，Li+，Co2+，阴离子NO3-，CO32-，HCO3-，SO42-，CH3COO-，Cl-，Br-，PO43-，亚硝酸根离子（NO2-），以及常见ROS物种一氧化氮（NO·），羟自由基（OH·），过氧化氢（H2O2），然后进行荧光光谱测试，再加入ClO-，待其反应完毕后再次进行荧光光谱测试.从图10可以看出，将其他干扰物加入到SPF溶液中时，探针的荧光强度变化微弱，当接着将ClO（-10 μmol·L-1）加入时，荧光强度明显增强，可以看出溶液的荧光强度变化与ClO-的加入密切相关，并且其响应不受其他干扰物存在的影响，表明探针SPF对ClO-有很好的选择性.

图10 SPF在干扰离子与ClO-共存条件下的相对荧光强度分布图（图中1—23分别是：Na+，K+，Cu2+，Ag+，Al3+，Mg2+，Ba2+，Fe3+，Ni+，Li+，Co2+，NO3-，CO32-，HCO3-，SO42-，CH3COO-，Cl-，Br-，PO43-，NO2-，NO·，OH·，H2O2）

2.2.3 不同pH环境对SPF荧光的影响

为了探究SPF的酸碱稳定性及不同pH值环境是否影响探针对ClO-的响应，进行了如下测试：选择V（丙酮）∶V（水）=9∶1的体系将探针配置成1×10-5mol·L-1溶液，通过盐酸和氢氧化钠调节体系的pH值，测试探针荧光，然后再加入ClO-（10 μmol·L-1），待其反应完毕后再次进行荧光光谱测试，测试结果如图11所示.在pH为3～11范围内探针的荧光强度基本不变，表明在广泛的pH范围内探针具有很好的稳定性.在加入ClO-条件下，随着pH值增大，荧光强度逐渐升高，在6～10的pH值范围内荧光强度比较稳定，继续增大体系pH值，荧光强度急剧增强.可以得出SPF是一个适宜在pH值在6～10范围内检测ClO-的荧光探针.

图11 SPF在有或无ClO-存在条件下的荧光强度随pH值的变化

2.2.4 SPF对不同浓度ClO-的响应测试

为了进一步研究不同浓度的ClO-对SPF的影响，设计了如下方案进行测试：首先选择V（丙酮）∶V（水）=9∶1的体系将探针配置成1×10-5mol·L-1，然后从小到大依次滴加不同物质的量浓度的ClO-溶液，形成一系列的浓度梯度，并待其反应完毕后进行荧光光谱测试，如图12所示.从图12中的荧光强度与HClO浓度的散点图可以看出，当向SPF溶液中加入不同浓度的ClO-时，随着ClO-浓度的增加，化合物的荧光强度逐渐升高，并表现出一定的剂量浓度依赖性.从散点图可以看出，在ClO-浓度超过20 μmol·L-1以后，随着ClO-浓度持续增加，SPF荧光强度还是不断增强，并没有达到饱和现象，可能跟测试时间较短（60 s），SPF与ClO-未完全充分反应有关.

图12 SPF对不同物质的量浓度ClO-响应（浓度依次为0，0.5×10-5，1.0×10-5，1.5×10-5，2.0×10-5，2.5×10-5，3.0×10-5，3.5×10-5，4.0×10-5，4.5×10-5，5.0×10-5 mol·L-1，反应时间为60 s）的荧光发射光谱图（激发波长372 nm）

为了进一步确定SPF的荧光强度变化与ClO-的浓度关系，以ClO-的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，做一个拟合曲线，如图12内插图所示.从拟合曲线可以看出，在ClO-浓度为0～20 μmol·L-1，荧光强度（Y）与ClO-浓度（X）存在一定的线性相关性，其拟合方程为Y=7.142 41X+65.675 57，根据3σ/k准则，计算出该探针对ClO-的检测限为2 μmol·L-1.因此，探针SPF对ClO-有很好的灵敏性且可以在一定浓度范围内进行定量检测.

2.2.5 SPF对ClO-响应的机理探究

图5中出现了等位点，表明在SPF溶液中加入ClO-后反应生成了新的物质.为了进一步探究SPF对ClO-响应的机理，进行了核磁滴定实验.发现在加入ClO-后的核磁共振图上出现了化学位移值为9.8的醛基峰，如图13所示.结合文献资料［19-21］，可确定加入ClO-后SPF的席夫碱结构被氧化断键，产生了醛基，具体机理如图14所示.

图13 SPF在加入ClO-前后的核磁滴定图

图14 SPF对ClO-检测机理图

2.2.6 双光子性能的测试

通过开孔Z-扫描实验测得SPF在THF中波长为800 nm的双光子吸收截面值为300 GM，如图15所示.SPF表现出良好的双光子吸收性能，预示着能在生物细胞双光子荧光成像方面得到较好的应用.

图15 在THF中SPF的开孔Z-扫描数据

3 结论

本文设计并合成了一种新型的螺二芴类双光子荧光探针，可以用于裸眼检测ClO-.荧光强度与ClO-浓度存在较好的线性相关性，可以用于ClO-的定量检测.探针对ClO-有很好的灵敏性和选择性，具有较好的双光子吸收性能，对环境和生物中ClO-的检测以及在生物细胞双光子荧光成像方面具有很好的应用前景.