栝楼籽蛋白酶解物的体外抗氧化及降血压活性

张瑾莉， 徐 敏， 杨 希， 朱丽娅， 袁翔宇

(1.安徽粮食工程职业学院， 安徽 合肥 230011；2.合肥工业大学 食品与生物工程学院， 安徽 合肥 230601)

0 引 言

随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，动脉粥样硬化和高血压发病率越来越高，已成为影响人们健康的重要因素，而且发病年龄越来越年轻化。研究表明，血管细胞氧化应激是动脉粥样硬化和高血压等这些血管慢性疾病的重要诱因之一[1-2]。

氧化应激是指生物体内氧化与抗氧化系统之间失衡，氧化产物多于抗氧化剂，从而导致细胞过氧化损伤，影响细胞正常功能的现象[3-4]。细胞内抗氧化剂表达水平的高低可反映出细胞内氧化应激情况及抗氧化作用[5-6]。

栝楼籽是我国传统中药栝楼的种子，其中的蛋白具有清除DPPH自由基及羟基自由基的功效[7]，显示一定的体外抗氧化性。但其在细胞水平的抗氧化作用及降血压活性相关报道较少。近年来，越来越多的学者利用酶解技术释放出天然蛋白中的小分子活性肽，这些酶解产物显示较好的抗氧化活性[8-9]。

因此，文中选用蛋白酶水解栝楼籽，制备栝楼籽蛋白酶解物(Protease hydrolysates of Trichosanthes seed， PHTS)，通过研究其对氧化损伤的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)存活率和抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)表达水平及缩血管因子内皮素(ET)分泌量的影响，探究其对血管细胞的抗氧化应激作用及其降血压效应，以期为动脉粥样硬化、高血压等血管相关疾病的治疗提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栝楼籽,购自安徽省安庆市潜山栝楼种植基地；

HUASMC细胞,购自中国科学院上海细胞库；

DMEM细胞培养基、FBS,购自以色列BI公司；

胰蛋白酶，购自美国Corning公司;

碱性蛋白酶、GSH,购自北京索莱宝公司；

CCK8,购自日本Dojindo实验室；

GSH检测试剂盒,购自武汉Elabscience生物公司；

ET检测试剂盒,购自山东博研生物公司；

CAT、SOD、GAPDH多克隆抗体及HRP 标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗,均购自武汉三鹰生物公司；

ECL化学发光试剂,购自Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 栝楼籽蛋白酶解物(PHTS)的制备

将鲜栝楼籽经干燥、去壳、粉碎、脱脂后，称取10 g，按料液比1∶10(m/v)加入3%碱性蛋白酶溶液1 000 mL，置于50 ℃、pH至9.00条件下水解，使用2.00 mol/L NaOH溶液保持pH至9.00，直至pH值不再变化，即视为水解反应结束，水解过程持续4 h，得到的栝楼籽蛋白酶解物水解度为15.73%。再置于90 ℃水浴10 min灭酶后，调节pH至7.00，再离心取上清液，浓缩并真空冷冻干燥，得栝楼籽蛋白酶解物粉末，标记为PHTS。

1.2.2 HUASMC细胞存活率检测

将HUASMC细胞按浓度4×104细胞/mL、每孔100 μL种到96孔板中，于细胞培养箱、37 ℃ 继续培养过夜。第二天取出，将细胞分组，分别设置HUASMC、HUASMC(H2O2)、HUASMC(H2O2+GSH)和HUASMC(H2O2+PHTS)组，其中，HUASMC(H2O2+PHTS)组设置0.625,1.25,2.50,5.00,10.00 mg/mL五种浓度。

各组细胞两次加样顺序及浓度见表1。

从表1可以看出，两次加样处理：第一次加样后，37 ℃孵育24 h；取出，进行第二次加样，37 ℃孵育4 h。再移除细胞上清液，每孔加入100 μL含10% FBS DMEM培养液和10 μL CCK8， 37 ℃孵育2 h。最后，用酶标仪测定波长450 nm处的OD值。

1.2.3 细胞总GSH水平及ET分泌量的检测

将HUASMC细胞按6×104个细胞/孔、2 mL培养基种于6孔板，置于细胞培养箱37 ℃培养过夜。表1中对各组细胞进行两次加样处理，此处HUASMC(H2O2+PHTS)组选用10 mg/mL浓度。移取细胞培养液，用试剂盒检测ET含量。将细胞经裂解、离心，取上清液，用试剂盒测定总GSH含量。

表1 各组细胞两次加样顺序及浓度

1.2.4 细胞CAT、SOD基因表达水平分析

如1.2.3中，将HUASMC细胞种于6孔板，进行两次加样处理。按照RNA提取试剂盒提取总RNA，再经逆转后，进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)，以GAPDH为内参。

引物设计如下：

GAPDH:(Forward)5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，(Reverse)5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;

CAT：(Forward)5′-TAAGACTGACCAGGGCATC-3′，(Reverse)5′-CAACCTTGGTGAGATCGAA-3′；

SOD：(Forward)5′-GAGATGTTACACGCCCAGATAGC-3′,(Reverse)5-AATCCCCAGCAGTGGAATAAGG-3′。

采用 2-△△Ct法计算各组CAT和SOD基因相对表达量。

1.2.5 细胞CAT、SOD蛋白表达水平分析

如1.2.3中，将HUASMC细胞种于6孔板培养并分组，进行两次加样处理。再裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白定量到同一浓度。每孔等量蛋白加样进行 SDS-PAGE 电泳，再转膜、漂洗、封闭、脱色。然后将膜置于一抗抗体稀释液中，4 ℃过夜，再漂洗。再将膜置于二抗抗体稀释液中室温孵育 1 h，再漂洗，用 ECL 化学发光法显影，在 Image J中分析条带灰度。

1.2.6 统计学分析

实验数据至少采用3个平行样本，数据结果用平均值±标准差表示，采用Graphpad Prism进行统计分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.000 1。

2 结果与分析

2.1 PHTS对氧化损伤HUASMC细胞活性的影响

CCK8试剂是一种细胞计数试剂，可在细胞线粒体中脱氢酶作用下生成黄色甲臜产物，甲臜产物的生成量与活细胞数量成正比，可间接由OD450值反映。

栝楼籽蛋白酶解物对氧化损伤HUASMC细胞活性的影响如图1所示。

图1 栝楼籽蛋白酶解物对氧化损伤HUASMC细胞活性的影响

图1结果显示，经H2O2损伤之后，HUASMC细胞存活率明显下降，而加入PHTS的HUASMC细胞存活率明显升高，且细胞活性与PHTS浓度呈正相关。其中HUASMC(H2O2+10 mg/mL PHTS)组细胞存活率最高，且显著高于GSH阳性对照组，故后续实验中，HUASMC(H2O2+PHTS)组均选用10 mg/mL浓度。

2.2 PHTS对氧化损伤HUASMC细胞总GSH水平的影响

栝楼籽蛋白酶解物对氧化损伤HUASMC细胞总GSH水平和ET分泌量的影响，如图2所示。

(a) 总GSH水平 (b) ET分泌量

GSH是细胞内最重要的非酶类自由基清除剂之一。图2(a)显示，经H2O2处理后，HUASMC细胞总GSH水平显著下降，而加入10 mg/mL PHTS处理的HUASMC细胞总GSH水平显著提升，显示较好的抗氧化应激作用。

2.3 PHTS对氧化应激HUASMC细胞分泌内皮素(ET)的影响

内皮素(ET)是生物体内的一种活性多肽，具有收缩血管功效[10]。其适量分泌有利于血管维持基本张力，但是过量分泌可引起血压升高。图2(b)显示，HUASMC细胞经H2O2氧化损伤后ET分泌量明显增高，而加入10 mg/mL PHTS处理可使ET分泌水平下降。因此，PHTS有利于降血压。

2.4 PHTS对氧化损伤HUASMC细胞内CAT和SOD基因表达的影响

栝楼籽蛋白酶解物对氧化损伤HUASMC细胞内CAT和SOD基因表达的影响，如图3所示。

CAT和SOD是细胞内最常见的两种抗氧化酶。图3结果显示，经H2O2损伤后，HUASMC细胞的CAT和SOD基因表达水平显著下降。而加入10 mg/mL PHTS，细胞的CAT和SOD基因表达水平显著提升，且高于GSH阳性对照组，有助于抗氧化。

2.5 PHTS对氧化损伤HUASMC细胞内CAT和SOD蛋白表达的影响

Western Blot检测各组细胞内CAT、SOD蛋白表达情况和灰度分析结果分别如图4和图5所示。

(a) CAT (b) SOD

图4 各组HUASMC细胞的CAT和SOD蛋白表达情况

(a) CAT (b) SOD

结果表明，与H2O2损伤组相比，加入10 mg/mL PHTS处理组细胞的CAT和SOD蛋白表达水平显著提升。

3 结 语

氧化应激是导致血管细胞损伤与功能失调的常见诱因之一，因此，开发抗氧化类药物是防治这些疾病的重要方向。栝楼籽蛋白酶解物可有效保护人脐动脉平滑肌细胞HUASMC的抗氧化系统，通过增强GSH、CAT、SOD等抗氧化剂的作用，从而抵抗H2O2引起的氧化应激损伤，提高细胞活性，减少细胞凋亡率。同时，还能抑制氧化损伤HUASMC细胞分泌ET，具有体外降血压活性。因此，本研究为防治动脉粥样硬化和高血压等血管疾病的药物研发提供了更多思路。