SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1在老年COPD患者中的表达及与肺功能指标的相关性

毛 俊，王 柯

1.湖北省武汉市优抚医院检验科，湖北武汉 430000；2.湖北省武汉市金银潭医院呼吸内科，湖北武汉 430040

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性、进行性气道炎症性疾病，好发于老年人，以持续性呼吸道症状和进行性气流阻塞为特征，严重影响患者肺通气功能[1]。全球每年因COPD死亡的人数已经超过 300万，尽管临床上在预防治疗COPD急性加重期方面取得了一定成就，但仍不能抑制疾病进展[2]。因此，寻找老年COPD相关生物学指标对改善患者预后十分重要。表面活性蛋白D(SP-D)是一种与肺先天免疫相关的钙依赖性凝集素，以多种方式介导病原体的清除，在肺宿主防御中发挥重要作用，被认为是诊断肺损伤的生物标志物[3]。趋化因子配体13(CXCL13)是B细胞趋化因子，可调节B细胞聚集至炎症病灶，在自身免疫性疾病中CXCL13合成增加，并且与疾病进展相关[4]。长链非编码RNA浆细胞瘤转化迁移基因1(lncRNA PVT1)是一种与肿瘤相关的lncRNA，参与肺癌细胞增殖分化及侵袭转移过程[5]。本研究拟探讨老年COPD患者血清中SP-D、CXCL13及lncRNA PVT1表达特点，并分析以上指标与肺功能的相关性，旨在为临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年3月至2021年5月湖北省武汉市优抚医院收治的300例老年COPD患者为研究对象。(1)纳入标准：①均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》诊断标准[6]；②年龄≥65岁；③入组前未接受过抗感染治疗。(2)排除标准：①合并肺组织良、恶性肿瘤及其他部位恶性肿瘤；②合并肺结核、哮喘、肺源性心脏病、感染性肺炎；③合并自身免疫性疾病。其中急性加重期患者135例(急性加重期组)，稳定期患者165例(稳定期组)，急性加重期患者均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)诊治中国专家共识(2017年更新版)》[7]相关诊断标准。另选择同期在湖北省武汉市优抚医院进行体检的65例健康者纳入对照组，均排除呼吸系统疾病、感染及免疫性疾病。所有研究对象自愿参与本研究，并签署知情同意书。本研究获得湖北省武汉市优抚医院医学伦理委员会批准。

1.2血清标本采集及检测 采集所有研究对象清晨空腹静脉血3 mL，注入干燥试管，室温下静置30～60 min，凝固后取上层液离心(参数：半径10 cm，转速3 000 r/min，时间15 min)，取血清于—70 ℃冰箱保存待检。采用Varioskan LUX 多功能酶标仪(美国赛默飞公司，比色夹心酶联免疫吸附试验)检测血清SP-D、CXCL13水平，试剂盒购自美国R&D公司。取血清标本，加入TRIzolTMplus RNA净化试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总 RNA，采用M-MLV反转录酶(美国Promega公司)将 RNA反转录为cDNA，采用Step One PlusTM实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)系统(美国赛默飞Applied Biosystems)进行qRT-PCR分析，采用2—ΔΔCt法计算lncRNA PVT1相对表达水平，lncRNA PVT1引物序列：正向引物为5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，反向引物为5′-AGAGACACCAAGACTGGCTCT-3′。β-actin(内参)正向引物为5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；反向引物为5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反应体系：DNA模板2 μL，正、反向引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，加RNase-Free ddH2O 21 μL。反应条件： 95 ℃预变性3 min， 98 ℃变性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环30次。

1.3肺功能指标检测 COPD患者入组当日、健康者体检当日，采用FGC-A肺功能测试仪(安徽电子科学研究所)检测第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1与用力肺活量(FVC)比值(FEV1/FVC)、FEV1占预计值百分数(FEV1%pred)。

2 结 果

2.13组基线资料、肺功能指标比较 3组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。急性加重期组、稳定期组合并基础疾病比例、吸烟史比例高于对照组，FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。急性加重期组FEV1、FEV1/FVC、 FEV1%pred低于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.23组血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达比较 急性加重期组血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达均高于稳定期组和对照组，稳定期组血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达与肺功能指标的相关分析 COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达均与FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈负相关(P<0.05)。见表3。

2.4SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鉴别COPD急性加重期和稳定期的效能 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鉴别COPD急性加重期和稳定期的曲线下面积(AUC)分别为0.707、0.671、0.696。SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1联合检测鉴别COPD急性加重期和稳定期的AUC为0.878，大于SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1单独检测的AUC(Z=5.922、6.741、6.470，P<0.05)，见表4和图1。

表1 3组基线资料、肺功能指标比较或n(%)]

组别n基础疾病糖尿病高血压高脂血症FEV1(L)FEV1/FVC(%)FEV1%pred(%)急性加重期组13562(45.93)*73(54.07)*54(40.00)*43.65±4.41*#56.80±5.79*#58.24±6.35*#稳定期组16580(48.48)*89(53.94)*62(37.58)*55.02±6.72*64.28±5.17*67.01±7.06*对照组6513(20.00)15(23.08)10(15.38)77.35±8.9579.26±7.0276.01±8.43F/χ216.53620.45413.005595.947333.056146.446P<0.001<0.0010.001<0.001<0.001<0.001

表2 3组血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达比较

表3 SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达与肺功能指标的相关分析

表4 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鉴别COPD急性加重期和稳定期的效能

图1 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鉴别COPD急性加重期和稳定期的ROC曲线

3 讨 论

COPD 是全球第三大死亡原因，吸烟、空气污染、职业暴露是COPD发病的高危因素[8]。老年人由于机体功能衰退，免疫力和抵抗力减弱，加之共病的影响，更容易发生COPD，持续的慢性炎症反应、渐进性气流受限导致气道狭窄，黏液阻塞，肺实质破坏和肺弹性丧失，影响肺通气功能。随着COPD症状加重和恶化，肺功能逐渐降低，严重影响患者的生活质量[9]。

SP-D是一种上皮细胞衍生的免疫调节剂，主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞和下呼吸道Clara细胞分泌，具有免疫调节、抗菌、参与肺初始免疫应答等作用，在维持肺表面活性剂稳态、肺先天免疫中发挥重要作用[10-12]。本研究发现急性加重期组血清SP-D水平高于稳定期组和对照组，表明SP-D与COPD发病及急性发作均有关，检测血清SP-D水平可反映COPD病情变化。相关分析结果显示，SP-D与FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈负相关，说明SP-D水平越高，肺功能损伤越严重，SP-D水平升高可能原因为响应肺组织局部炎症刺激，肺组织损伤越严重，肺泡表面合成SP-D越多。LPEZ-CANO等[13]报道SP-D水平在肥胖2型糖尿病肺损伤患者血清中升高，且与FEV1呈负相关。YAMAKAWA 等[14]研究结果显示，血清 SP-D 水平升高是系统性硬化症和混合性结缔组织病并发间质性肺疾病的潜在预测因子，与肺活量下降有关。分析SP-D参与COPD的机制为转化生长因子β可诱导SP-D水平升高，且可调节肺泡上皮细胞及免疫细胞，在炎症环境中转化生长因子β增加 SP-D表达，从而参与宿主免疫防御[15]。

CXCL13是一种B淋巴细胞趋化因子，由滤泡树突细胞和巨噬细胞在次级淋巴器官中产生，CXC 趋化因子受体5是CXCL13的受体，CXCL13通过激活CXC 趋化因子受体5调节B细胞和T细胞亚群归巢，在免疫反应调节中发挥重要作用[16]。本研究发现血清CXCL13水平在COPD患者中也明显升高，且在急性加重期更高，说明CXCL13可促使COPD发病和病情加重。本研究中相关分析结果显示，CXCL13水平与肺功能指标呈负相关，提示CXCL13水平升高可诱导肺功能下降。ALTURAIKI等[17]研究结果显示CXCL13水平在呼吸道合胞病毒感染小鼠模型中升高，并促使气道淋巴细胞聚集。XUE等[18]报道血清CXCL13水平升高与间质性肺疾病的严重程度显著相关，是间质性肺炎诊断的标志物。分析CXCL13参与COPD的可能机制为三级淋巴器官(也称异位淋巴样组织)在COPD 进展中起关键作用，T滤泡辅助样细胞表面CXCL13在树突状细胞诱导下表达增加，并促使异位淋巴样组织产生[19]，异位淋巴样组织可促使肺组织病理纤维化、肺功能恶化[20]。

lncRNA PVT1是原癌基因 N-myc的下游基因，在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中表达上调，并与肿瘤预后密切相关[21]。已知lncRNA PVT1参与哮喘发病，lncRNA PVT1通过负向调控miR-15a-5p或海绵miR-29c-3p，激活磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶-B-哺乳动物雷帕霉素靶分子信号传导，促使CD4+T 细胞向辅助性T细胞2分化，从而诱导气道炎症反应发生，促进气道平滑肌细胞增殖和气道重塑[22]。本研究发现lncRNA PVT1与COPD也存在密切关系，lncRNA PVT1高表达与肺功能下降有关，分析可能的原因为miR-146a是lncRNA PVT1的靶点，也是公认的慢性气道呼吸系统疾病的抗炎介质，可抑制COPD肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、白三烯B4等致炎介质表达，发挥保护作用[23]，miR-146a是lncRNA PVT1的下游靶标，lncRNA PVT1通过负向调控miR-146a诱导炎症反应，参与COPD发病过程[24]。

综上所述，老年COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表达均升高，高水平SP-D、CXCL13，高表达lncRNA PVT1与COPD急性加重及肺功能下降均有关。本研究不足之处为尚未分析SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1与老年COPD患者临床治疗结局的关系，待进一步追踪临床治疗结局加以证实。