利用FQ-RTPCR定性检测RNA病毒核酸的质量控制要点分析

文/薛达冰

目前，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RTPCR)已经广泛应用于临床RNA病毒核酸定性检测。FQ-RTPCR具有许多优势：（1）FQ-RTPCR在封闭的8联管中进行，无须进行后处理，产物污染少，假阳性发生率比较低；（2）能够实现自动化，结果简单明了；（3）工作效率高，可以实现样本高通量检测；（4）灵敏度高、特异性强，能快速、准确完成核酸样本检测。但是，在近期的临床实践中发现，核酸检测结果会出现与临床诊断不符，出现假阳性或假阴性的现象，检测结果有时会受到质疑。因此，核酸检测的质量控制是当下临床检验工作者重点关注的问题。为此，本文将从以下三个方面阐述利用FQ-RTPCR定性检测RNA病毒核酸的质量控制要素，为提高核酸检测结果准确性提供保障。

1 分析前的质量控制

1.1 样本运输与保存

在自然条件下存在着大量的RNA酶。有研究表明，RNA病毒的核酸在室温条件下极易降解。因此，在RNA病毒样本采集后，应立即将样本置于的RNA病毒核酸专用保存液中，并尽快安排送检，并用冰袋保持样本处于低温状态。如果采集后的样本不能及时送检，则应将样本存放于4℃中保存。标本送到实验室后，实验室工作人员尽快安排检测，如果样本能在24h内检测，则可置于4℃保存；若样本在24小时内无法将样本检测完毕，则应将样本放于-70℃冰箱保存。

1.2 实验室设施

在PCR实验室，用于进行实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应的仪器主要有实时荧光定量PCR仪、全自动核酸提取仪、生物安全柜、冰箱、移液器、小型低速离心机等。在仪器投入使用前，必须对所有仪器设备进行校准以及性能验证，评估整套设备的重复性、准确性、最低检测限等，只有结果符合要求才能投入使用。仪器在使用的过程中不可避免出现仪器老化、性能下降，由此出现仪器系统误差的情况。定期对核酸检测的主要仪器进行校准，对校准不通过的仪器因此，需要暂停使用并进行查找原因对症处理，最后再次进行校准，校准后的仪器通过性能验证后才能投入使用。对仪器设备定时校准是保证核酸检测结果准确的关键。

1.3 检测试剂耗材

在核酸检测过程中主要用到的试剂有核酸提取试剂和核酸扩增检测试剂。投入使用的核酸提取试剂主要的原理方法有磁珠法、柱提法、煮沸裂解法等。煮沸裂解法是比较简单的核酸提取方法，但是主要的缺点是提取后的核酸存在较多的杂质，这对后续的核酸扩增反应有着较大的抑制作用，容易产生假阴性的结果。目前，临床上使用较多的方法为柱提法和磁珠法，柱提法主要是通过手工进行提取，成本比较低，方法简单，而且不需要比较高端的仪器设备，主要用于标本量比较少的实验室，而磁珠法可以实现仪器自动化，核酸提取时间短，可进行高通量提取核酸，适用于大批量标本检测的实验室。在选择核酸提取试剂时，我们建议选择标本加样量大，并且最终的核酸洗脱液体积小的提取试剂，以获得高浓度的病毒RNA，提高检出率。目前，市场上针对不同的RNA病毒都会有多种相应的核酸扩增检测试剂，选择检测限低、准确度高、重复性好的核酸扩增试剂是提高核酸检测质量的关键。在使用新的品牌试剂或者新批号的试剂前都应对该试剂进行性能验证，认真评估该试剂的重复性、准确性、最低检测限等性能，只有检测结果符合要求才能正式投入使用[8-9]。

RNA病毒核酸检测的实验耗材质量的好坏也将直接影响到后续核酸扩增检测的结果。我们应使用质量可靠的耗材，包括离心管、八联管、各种不同规格带滤芯的吸头。实验室应对新批号、同一批号不同货运号的关键耗材进行验收，重点关注实验耗材的批间差异、抑制物等。此外，我们对八联管还应关注其是否存在爆管的可能，应将新批号、同一批号不同货运号的八联管置于扩增仪上进行高低温多次循环，观察八联管是否存在爆管。对各种不同规格带滤芯的吸头我们也应关注其密闭性是否良好，对于密闭性不良的带滤芯的吸头，退回给厂家，拒绝使用。

1.4 工作人员

核酸检验人员贯穿整个核酸检测的过程，是影响核酸检测结果的关键。PCR实验室的手工操作环节较多，比较烦琐，每个环节都有可能对最终的结果产生影响。因此，必须保证核酸检验人员拥有扎实的理论基础、规范的操作、PCR上岗证或核酸检测合格证、生物安全合格证等。检测人员必须经过培训并考核合格后方能上岗。在工作的过程中，必须严格按照预先制定好的操作规程进行。此外，实验室还应定期组织实验室相关技术人员参加实验室内部比对活动，确保不同技术人员检测实验室内部比对样本的实验结果在可控范围之内，保证实验结果精确度、准确度在国家允许的范围内。

2 分析中质量控制

试剂配制是RNA病毒核酸检测的关键步骤之一。在配制试剂前，检验人员应穿戴好防护用品。例如帽子、口罩、鞋套等，避免外来的核酸片段污染试剂，并保证吸取试剂准确无误，做到充分混匀，这是保证所后续检测质量的关键。在利用FQ-RTPCR定性检测RNA病毒的过程中，每个批次应设置三个阴性质控、一个弱阳性质控，质控品应随机放到样品中一起参与提取、扩增的过程。三个阴性质控品主要监测提取样本核酸过程及环境是否受到污染。我们建议使用弱阳性质控品参与核酸提取、核酸扩增的过程。弱阳性质控能更灵敏反映出核酸检测体系的检测水平，监测是否存在假阴性的问题；而且弱阳性质控品在提取过程中产生的阳性基因片段气溶胶污染概率较低。

3 检测后质量控制

3.1 核酸检测结果的判读

判断某批次的核酸检测结果是否准确，首先，查看该批次的质控是否在控。如果质控结果为失控，则应对失控的原因进行分析，找出问题。只有质控在控，这一批次的核酸检测结果才可以正常报告。其次，对于每一份样本的核酸检测结果应该按照说明书提示的方法来判读，不能仅仅根据个人工作经验来判读结果，否则极有可能做出错误的判断。

3.2 实验室污染控制

FQ-RTPCR是一个高灵敏度的技术，微量的靶基因污染都会引起假阳性的结果，因此，PCR实验室防污染是提高核酸检测质量的关键因素之一。PCR实验室的技术人员必须严格按照实验室的标准操作规程进行试验，以降低实验室受到核酸污染的风险。在工作时，工作人员必须按照工作的单一方向进行实验。所有的耗材必须严格分区使用，并在各区的耗材上写上各区的标志，不能将耗材相互串用，否则将会极易引起核酸污染。在工作中要时刻注意可能会引起的核酸污染，在打开样本盖子的过程中，应该注意尽量避免在核酸提取板上方打开盖子，否则会出现样本携带污染，影响结果的准确性。提取核酸后，用于提取核酸的搅拌套应该用密封袋装好并密封后才丢弃，避免搅拌套携带阳性质控的核酸挥发到样本处理区，尽量降低阳性质控的核酸日积月累导致实验室发生污染的风险。

我们需要定期对实验室的工作区间、仪器设备进行清洁消毒。主要步骤包括：（1）使用75%酒精对精密仪器设备、工作台面等进行擦拭；（2）在PCR每个区喷洒75%酒精用于沉降悬浮于空气中的部分核酸片段；（3）使用浓度为1000mg/L含氯消毒液对实验室的地面、污染区等进行彻底消毒；（4）实验结束后开启紫外灯照射2h以上，如果有条件可以照射过夜，使得实验室的基因片段彻底变性。

4 小结

利用FQ-RTPCR定性检测RNA病毒核酸的整个流程包括检验前、检验中、检验后，其每个细节都有可能对最终的结果产生比较大的影响。在临床实践过程中，如果不严格控制检验质量，这将会严重影响着临床的正确诊疗。因此，只有不断提高FQ-RTPCR的质量控制水平，对检验质量进行严格把关才能保证检验结果的正确性，才能为临床提供有价值的检验报告。