基于分子影像学评价STAT3因子在肺腺癌治疗中的作用

郝利国 佟 旭 李国华 谷弘谦 李忠涛

(齐齐哈尔医学院医学技术学院分子影像学研究室 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

肺癌是人类发病率和死亡率都比较高的肿瘤疾病之一，其中早期肺腺癌诊断是最常见的一种肺癌临床病理学诊断类型[1]。早期肺腺癌一般生长缓慢，倍增持续时间长，可伴恶性血行细胞转移,临床诊断治疗初期效果欠佳[2]。近年来，以早期肺腺癌患者相关病理分子肿瘤标志物检测为治疗目标的分子检测治疗方式为早期肺腺癌的发病风险评估、及恶性肿瘤早期监测治疗赋予了希望，研究发现早期恶性肺腺癌的相关病理因子分型在不同肿瘤发展周期阶段之间存在异质性，这对于早期肺腺癌的早期预防诊断治疗具有重要指导意义[3-4]，而通过研究高能X射线诱导肺癌细胞早衰，分析其分子层面的早衰机制，将为临床诊治肺癌提供启示性方向。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 细胞培养：人肺腺癌肿瘤A549细胞；新型人源性肺癌肿瘤h1299细胞；细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中，连续进行低温培养，所有试剂均用去离子水配置。

1.1.2 主要仪器设备：激光粒度定量测定仪；透射电子显微镜；细胞培养箱；低速台式细胞离心机；智能荧光酶标倒置电子显微镜；多功能荧光酶标仪

1.2 细胞实验

取两个细胞对数生长期的细胞H1299和细胞A549细胞,使用直线加速器对细胞进行直线照射,SSD=100cm,细胞吸收的高能量照射浓度为10mV。A549细胞为贴壁细胞,瓶底中心点和细胞中心点吸收剂量分别为0gy、2gy、4gy以及8gy，分为两个单数对照组和一个对照组。每组以105/ml板平铺于6孔板中，每孔分别加入2ml的细胞培养液，对照组不需要做染色处理，AG490组分别加入终止总浓度为20μm/ml的AG490抑制药试剂，RAPA组分别加入终止总浓度为1μm/ml的RAPA抑制药试剂，于24h、48h及72h分别进行两组β-半胱葡乳糖酸染色计数；同时将4gy组进行同剂量照射的3组细胞提取受体细胞,4gy组、4gy+AG490组分别进行加入终止总药物浓度为20μm/ml的AG490抑制性抗药照射试剂、4gy+RAPA组分别进行加入终止总药物浓度为1μm/ml的抑制性抗药照射试剂，对照组提取细胞；0gy组进行相同剂量进行照射，于72h收取进行提取受体细胞，两组细胞提取受体细胞中的蛋白质，均可应用于自体免疫细胞蛋白质和自体免疫细胞中的印迹特征染色抑制实验。

1.3 细胞衰老率检测

将H1299和A549细胞培养溶液均匀铺于24孔板中，加入250μl的β半胱葡乳糖酸核苷酶溶液作为下次染色固定液，室温固定30min后加入250μl重的染色细胞工作液，避免反光用白色保鲜膜紧紧封住24孔板隙以防止溶液蒸发。37℃在保温箱染色孵育细胞过夜后，加入0.5ml的染色PBS，普通的荧光学者在显微镜下实时观察细胞染色实验结果并进行计数，统计其对β半胱葡乳糖酸核苷酶染色阳性细胞的染色百分比。

1.4 细胞转染

H1299和细胞A549细胞培养至对数期后,以106/ml培养方式将其种植于6孔板中,每孔一次后再加入2ml的细胞培养液,待每次加入后的培养细胞融合度70%时,进行质粒蛋白细胞进行迁移接受转移感染,用于检测细胞免疫蛋白表达，以及检测质粒细胞血球蛋白免疫细胞表达。

1.5 蛋白质印迹

细胞中的主要细胞裂解蛋白上清裂解液主要提取裂解于原细胞中的H1299和次要裂解细胞A549细胞，加入乙酰氨基酸二磷酸酶催化裂解反应抑制剂，及其他细胞上清蛋白酶催化裂解反应抑制液试剂，5%浓度室温分离脱脂奶粉成膜采用浓度室温高压加热方式封闭60min,使用多维激光浓度增强化学发光成像扫描仪方法即可进行图像显色，以βactina作为主要成像内参,imageoc图像浓度分析效果图本应用软件进行图像浓度分析主要研究目的也就是测定血蛋白的各种生物化学表达以及浓度测定水平。

1.6 统计学方法

采用两组差异样本配对，比较方法采用t方法进行配对检验,以差异配对结果p<0.05为结果计算出的差异配对值具有效的结合统计学习和现实意义。

2 结果

加入新的STAT3磷酸化物作为抑制剂后，以及加入AG490同样均可显著有效上调抑制肿瘤细胞H1299和A549细胞的肿瘤生长晚期早衰，加入STAT3可显著抑制促进肿瘤细胞生长H1299和其在新的A549细胞内的生长早衰。高能活性x光激光细胞照射在癌细胞中均可显著有效抑制上调肿瘤细胞生长；AG490和新的原有rapa同样显著有效抑制了高能活性使用x射线光电子辐射线微波激光细胞诱导的肿瘤细胞H1299和其在新的A549细胞内的生长早衰。(如图1)

图1 实验组和对照组中STAT3、53和P16的表达情况

成功建立以STAT3为把靶点的探针，分别称取50mg、100mg、150mg、200mg样品配制成不同浓度的溶液,置于5ml离心管内，静止72h无浑浊、分层现象。探针的尺寸分布较窄,表明粒径分布较为统一(图1)。

zeta电位稳定性良好，随着成像探针的辐射浓度的逐渐升高，T1信号强度逐渐增强(如图2)。靶向实验结果良好，探针对于肿瘤的检出率高达90%，且随STAT3表达的增加而增加,可以有效实现癌症的早期诊断。

注：左图为不同浓度下的探针T1WI成像图像

注：左图为探针粒径分布直方图

3 讨论

STAT3因子是一种介导肿瘤细胞间遗传信号转导的重要细胞转录激活因子，参与肿瘤细胞基质分化、免疫代谢应答、胚胎生长发育等多种细胞生理活化过程[5]。近年来,大量临床研究成果显示,STAT3在多种恶性肿瘤中异常转录活化，并与恶性肿瘤上皮细胞的异常增殖、凋亡、转移等多种生物学生理行为紧密密切相关[6]。衰老是阻止癌细胞增殖的肿瘤抑制机制，氧化损伤、端粒功能障碍、电离辐射引起的DNA损伤反应和化疗药物都可引起不可逆的细胞衰老 。2015年science的一百多篇文章 分别提出目前已知的肺癌细胞周期早衰相关通路主要有三条,分别由三条p16、p53、p62介导,其中p16、p53通过诱导影响细胞周期早衰停滞进而诱导引起其他细胞周期早衰，基于上述相关研究结果，提示我们在使用x和放射线因子诱导治疗肺腺癌后的细胞周期早衰中，STAT3和放射线因子诱导的肺癌细胞周期早衰相关通路最有可能为三条STAT3-cav1-p53、STAT3-p16等而关键因子为STAT3 。此外，STAT3还与肿瘤细胞的辐射抗性有关，抑制STAT3表达能使一些肿瘤细胞的辐射敏感性增强 。其中基于STAT3的介导抗药性凋亡基因机制可能是通过辐射后导致A549细胞内在放射线中抗性浓度增加的重要原因之一，但STAT3介导的辐射影响导致A549细胞通过辐射产生抗性的基因机制目前还不明确。

本文的研究结果发现新的STAT3参与H1299和A549细胞慢性早衰的正常调控，高能量的x射线细胞照射技术可通过细胞激活新的STAT3，诱导旧的H1299和新的A549细胞从而发生慢性早衰。成功建立以STAT3为把靶点的探针,可以有效实现肺腺癌的早期诊断。

肺癌前期检查无明显的临床症状，进展迅速，因而早期手术率和切除率低。此外，术后的局部细胞复发及远处细胞转移，导致其临床疗效不佳，阻断性的STAT3信号分子通路发展可以显著用于改善恶性胰腺癌肿瘤细胞的早期生物学分化行为，因此阻断STAT3信号分子通路可能发展成为目前治疗恶性胰腺癌的重要药物治疗方式 。综上所述，对Jak/STAT3信号分子通路技术进行更深入的科学研究，能够为促进胰腺癌的早期治疗发展提供新的治疗方法。电离辐射因素会诱发一些患早期肺癌的干扰体细胞发生慢性晚期早熟衰老[13]。但目前的一些临床医学研究仅限于分别揭示肺癌细胞慢性早衰现象，而对其更上游的与慢性早期放射性干细胞功能损伤早期肺癌细胞发生反应密切的相关联的肺癌细胞基质调节机制，以及下游的被细胞激活后的早衰肺癌细胞对该蛋白的受体调节反应机制研究较少。这也是我们下一步的医学临床研究中的重点。