奶牛场沙门氏菌分离株的流行特征及抗性分析

杨若璇，唐凯伟，朱成林，陈娟，刀筱芳，唐俊妮

（西南民族大学食品科学与技术学院，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都 610041）

沙门氏菌（Salmonella）是世界范围内引起食品公共安全问题的主要食源性致病菌之一，被列为牛乳及其制品中微生物检测的主要对象之一[1]。牛乳品质的好坏与否取决于奶牛养殖场的环境以及牛乳生产加工各环节的卫生状况[2]。沙门氏菌会引起奶牛腹泻[3]，减低奶牛产奶量，导致牛乳品质降低，给奶牛养殖业造成一定的经济损失[4]。为了防止奶牛感染致病菌，在养殖期间使用抗生素、消毒剂，甚至滥用抗生素成了主要的防控手段[5,6]。每年我国在养殖场中都会过量使用抗生素，导致我国抗生素的使用量在全球的占比很高[7]。这也导致养殖场中耐药细菌的广泛存在[8]。奶牛养殖业目前呈现出规模化的发展，导致奶牛养殖密度变大，病原微生物传播途径缩短，有效的消毒杀菌是奶牛养殖场防控致病性微生物的重要保障[9]。Shaibu 等[10]通过对屠宰场被屠宰的牛以及加工环境标本中的沙门氏菌进行抗菌谱测定，发现分离菌株对3～5 种抗生素产生抗性，表现为多重耐药。赵俊利等[11]针对内蒙古地区奶牛源致病性沙门氏菌的耐药特性及基因分析，发现内蒙古地区奶牛源致病性沙门氏菌对甲氧苄啶及磺胺甲基异唑的耐药率最高（97.4%），对多数β-内酰胺类、氨基糖甙类、氯霉素类及四环素类药物的耐药性也较为严重（耐药率为40%～80%），菌株的多重耐药率为94.7%，提示临床抗菌药物不合理使用可能是该地区奶牛源沙门氏菌耐药性产生的主要原因。消毒剂是目前食源性致病菌防控的有效手段[12]，广泛用于控制食品生产设施和环境中的微生物污染[13]。但是，消毒剂的广泛使用同样引起人们对其可能参与抗生素耐药性发展的担忧，特别是对抗生素共同耐药的关注[14]。李帼宁等[15]揭示了社区环境中分离鉴定的沙门氏菌以B 群鼠伤寒沙门菌为主要菌型，其耐消毒剂基因携带率较高，并且以qacEΔ1基因为主要携带类型，菌株对消毒剂和抗生素抗性具有协同效应。沙门氏菌可从畜禽动物宿主中获得耐药性，通过食物链引起人类感染[16]。只有科学管理和合理使用抗生素，才能有效控制人畜共患沙门氏菌病，保障食品安全和人类健康[17]。因此，调查奶牛场沙门氏菌分离株的流行特征和抗性分析，可为奶牛场沙门氏菌的防控以及抗生素、消毒剂的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标准菌株和实验材料

本试验所需主要培养基及试剂见表1。阳性对照菌株为沙门氏菌H9812（SalmonellaH9812），由本实验室保存。

表1 主要培养基及试剂Table 1 Main media and reagents

1.2 主要仪器

本试验所需主要仪器见表2。

表2 主要仪器Table 2 Main instruments

1.3 样品采集

2020 年7 月至11 月，分五个批次从成都市某规模化奶牛场的环境、产奶过程各环节、以及奶牛粪样中共采集700 份样品。其中，奶牛场环境样品78 份，健康奶牛粪样88 份，健康奶牛乳头89 份，健康奶牛奶样48 份，挤奶器89 份，腹泻奶牛粪样118 份，腹泻奶牛环境97 份，腹泻奶牛乳头49 份，乳房炎奶牛粪样44 份。

1.4 细菌分离、鉴定与血清型鉴别

参照国标GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学 沙门氏菌检验》方法进行样品分离鉴定。使用水浴法提取沙门氏菌的DNA 模板[18]，以沙门氏菌的特异性invA基因引物进行PCR 扩增，具体引物序列为：上游引物：CCCTTTGCGAATAACATCC；下游引物：ATTACTTGTGCCGAAGAGCC[18]。PCR 反应体系20 μL：包含Taq 1.1×T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸30 s；共35 个循环，72 延伸2 min。沙门氏菌的血清型参照沙门氏菌属诊断血清说明书进行操作，鉴定结果参考国家标准GB/T 4789.4-2010《沙门氏菌检验标准》进行判断。

1.5 药敏试验

药敏试验参考美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards in Stitute，CLSI）推荐的Kirby-Bauer 纸片扩散法，结果按照CLSI 的标准进行判定[19]。药敏纸片购置于赛默飞公司，抗生素类型与使用剂量见表3。

表3 抗生素药物及其使用剂量Table 3 The antibiotic drugs and their dosages

1.6 耐药基因、毒力基因、抗消毒剂基因检测

DNA 模板制备同1.4，采用PCR 扩增27 种耐药基因，13 种毒力基因，5 种抗消毒剂基因，其引物序列、扩增片段长度及退火温度见表4，PCR 反应体系同1.4。

表4 耐药基因、毒力基因、抗消毒剂基因引物序列信息Table 4 Primer sequence information of drug resistance genes,virulence genes and antidisinfectant gene

续表4

1.7 对不同消毒剂MIC 值的测定

根据消毒剂化学结构以及作用机理特征，参考CLSI 推荐方法及判断标准法测定不同消毒剂对沙门氏菌MIC 值[19]，采用二倍稀释法，将9 种消毒剂（表5），以消毒剂厂家推荐喷雾使用浓度为中间值，分别向上、向下稀释梯度浓度，将其混合溶解于营养肉汤培养基中，接种100 μL 制备好的菌悬液，每株菌做3 个重复，根据沙门氏菌的生长情况，确定不同种类消毒剂抑制受试沙门氏菌生长的最低浓度，即为MIC 值。

表5 9 种消毒剂成分以及使用浓度Table 5 The ingredients of 9 disinfectants and concentration

1.8 数据统计分析

数据采用Microsoft Excel 软件初步进行整理分析，统计学分析采用SPSS 20.0 软件，作图采用GraphPad Prism 8（v8.0.2.263）软件。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定及血清型分布

通过选择性培养基以及沙门氏菌特异基因invA检测，从成都地区规模化奶牛场环境中各环节及牛乳在生产过程中采集700 份样品，共分离鉴定出16 株沙门氏菌（2.29%，16/700）。从奶牛场环境1 株（1.28%，1/78）；健康奶牛粪样1 株（1.14%，1/88）；腹泻奶牛粪样6 株（5.08%，6/118）；腹泻奶牛环境5 株（5.15%，5/97）；腹泻奶牛乳头2 株（4.08%，2/49）；乳房炎奶牛粪样1 株（2.27%，1/44），结果显示该奶牛场采奶环节中沙门氏菌的污染范围较为广泛。冯兰等[23]对四川省阿坝州红原县采集腹泻牦牛样品，16 份样品共计分离出16 株沙门氏菌，沙门氏菌检出率达到100%。说明密集的养殖场环境可致使病原菌在奶牛场之间的传播风险更高，感染率高且造成的影响和危害更为严重[24]。奶牛养殖业是我国畜牧养殖重要的产业之一，其中，细菌性腹泻中的沙门氏菌是严重危害养殖场中畜禽健康的一类致病菌，且在奶牛养殖环节以及牛乳生产过程中也经常会发生食源性微生物的污染进而引起人的传染。

进一步，采用沙门氏菌属诊断血清试剂盒从分离菌株中鉴定出4 种血清型，包括肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，详见表6。其中甲型副伤寒沙门氏菌为优势血清（n=6，37.50%）、肠炎沙门氏菌（n=6，37.50%），其次，鼠伤寒沙门氏菌（n=3，18.75%）、婴儿沙门氏菌（n=1，6.25%）。在中国，沙门氏菌流行的血清型众多[25]。张树栋等[26]发现牛源沙门氏菌的血清型多为鼠伤寒沙门氏菌或者都柏林沙门氏菌，这与本试验研究结果大致相似，血清型的差异可能是由于地理区域、季节和采样方法的不同导致，也表明奶牛场中沙门氏菌容易在各种环境中交叉污染。

表6 沙门氏菌血清型分布情况Table 6 Distribution of Salmonella serotypes

2.2 药敏试验

16 株沙门氏菌对20 种常见抗生素的耐药表型如表7所示，分离菌株对杆菌肽和利福平的耐药性最高，为100.00%（16/16），其次是氨苄西林，检出率为93.75%（15/16），对亚胺培南、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星和头孢他啶这6 种药物的耐药率均为0。此外，分离菌株还对多种抗生素表现为中介，如对链霉素（75.00%）、庆大霉素（62.50%）、阿米卡星（62.50%）等。本研究结果与何名扬等[27]及加春生等[28]的研究结果相似，包东武等[29]研究指出在对沙门氏菌及各类细菌传染性疾病进行治疗过程中，需要谨慎性用药。因为按规定使用抗生素能够有效降低沙门氏菌耐药性的产生[30]。该奶牛场在针对治疗沙门氏菌引起的患病奶牛时，建议使用氟喹诺酮类抗生素药物。

表7 沙门氏菌分离株对20 种抗生素的药敏结果Table 7 The results of susceptibility of Salmonella isolates to 20 antibiotics

从表8 可以看出16 株沙门氏菌分离菌株的耐药表型均为多重耐药性，分离菌株对3 种以上抗生素表现为耐药。优势多重耐药谱为：杆菌肽（B）、氨苄西林（AMP）、利福平（RFP），说明该奶牛场沙门氏菌分离菌株存在多重耐药现象。

表8 分离菌株多重耐药谱Table 8 Multidrug resistance profiles of Salmonella isolates

2.3 抗生素耐药基因检测结果

27 种耐药基因检测到24 种，检出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%），未检测到qnrC、aaC3和tetG耐药基因。检测结果如图1。四环素类耐药基因中，tetB基因的携带率高达93.75%，分析原因可能跟早期使用四环素类抗生素有关。16 株沙门氏菌分离菌株中有一半以上的分离菌株携带磺胺类耐药基因，经询问磺胺类药物也是该奶牛场主要的治疗用药。氯霉素类耐药基因中stcM携带率为50.00%，cmlA携带率为12.50%。分离菌株中携带率较低的是链霉素类strB基因，仅1 株分离菌株携带。通过分析耐药基因检测结果发现与张文宇[30]、冯兰[31]等研究结果存在一定差异，表明不同地区、不同时间采样的沙门氏菌耐药性存在不同。

图1 沙门氏菌不同耐药基因检测结果Fig.1 Results of different drug resistance genes in Salmonella

2.4 毒力基因检测结果

针对13 对毒力基因，检测结果显示，详见图2，分离菌株携带12 种不同的毒力基因，未检测到ssaR毒力基因。Dlamini 等[32]从牛粪便和生牛肉样本中分离出300 株沙门氏菌，27.10%的分离株具有spvC基因，来源不一样的沙门氏菌携带相同的毒力基因时，所表现出的致病性不同[33]。研究发现质粒上携带的毒力基因更加具有致病性[34]，如spvC基因在质粒上，可发生转移。此外spvC基因的产物与毒力表型具有一定的相关性，有利于沙门氏菌在肠外组织细胞内生长[21]。宋雪等[35]研究发现，毒力基因的携带情况与宿主的健康程度相关，进一步证实了毒力基因的携带率与致病性呈正相关[36]，毒力基因检出率越高，沙门氏菌潜在致病性就越强。可以确定该奶牛场奶牛腹泻的原因与携带多种毒力基因的沙门氏菌有关，这些毒力基因的存在可能会促进沙门氏菌向宿主的入侵，并且奶牛的发病率相关。

图2 沙门氏菌不同毒力基因检测结果Fig.2 The results of different virulence genes in Salmonella

2.5 抗消毒剂基因检测结果

抗消毒剂基因的检测结果如图3，除qacG未被检出外，16 株沙门氏菌分离菌中4 种基因均有检出，其中qacEΔ1基因检出率最高为56.25%。杨盛智等[37]在研究鸡蛋生产链中沙门氏菌对抗生素及消毒剂的耐药性中也仅检测出qacEΔ1消毒剂耐药基因，且发现所有检测出qacEΔ1基因的菌株均对抗生素产生抗性。本研究结果与之相似，说明qacEΔ1基因在不同来源、不同环境中的沙门氏菌分离菌株中的检出率均较高。

图3 沙门氏菌抗消毒剂基因检测结果Fig.3 The results of different anti-disinfectant genes in Salmonella

2.6 不同消毒剂对分离出的16 株沙门氏菌MIC 值分析

9种消毒剂对16株沙门氏菌分离菌株消毒效果MIC值的比较，结果如表9 所示，除了G 消毒剂，其它8 种消毒剂的最小抑菌浓度均高于厂家推荐使用浓度。

表9 消毒剂厂家推荐使用浓度与试验使用浓度Table 9 Recommended concentration and test concentration of disinfectant manufacturer

分离菌株对9 种消毒剂敏感程度都较为广泛，稀释的浓度梯度跨度也较大。研究发现，消毒剂成分相同但品牌不同的消毒剂MIC 值也存在差异，分析可能与消毒剂原始浓度有关，从消毒剂对受试菌株的抑菌效果可以看出，消毒剂A、C、D、H 在30 min 内可以就能够达到杀菌率100%；消毒剂B、E、F、G、I 均在60 min 内可以达到100%的杀菌率，详见图4。

图4 9 种消毒剂不同时间抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of 9 kinds of disinfectants at different times

针对牛乳加工环节和环境消毒灭菌尤为重要，有效的消毒是奶牛场疫病防控的重要保障。质粒型消毒剂抗性基因家族中qac基因最为常见，其编码的外排泵蛋白可排出双胍类消毒剂和季铵盐类消毒剂。李帼宁等[15]揭示沙门氏菌抗消毒剂基因携带率较高与多重耐药菌株消毒剂抗力较高密切相关。何雪萍等[37]研究认为长期使用消毒剂会导致动物养殖场中沙门氏菌对喹诺酮类药物的耐药性增强。针对该奶牛场的日常环境、器具消毒，建议多种类消毒剂定期交替规范使用，可减少致病菌耐药性的产生。

2.7 不同巴氏杀菌温度对沙门氏菌的杀菌效果

通过查阅相关文献[38]，在不影响牛乳品质和风味的情况下，选择低温保持式杀菌法对全脂乳和脱脂乳中的沙门氏菌进行巴氏杀菌，针对巴氏杀菌中的低温保持式杀菌法进行了温度的探究试验。如图5 所示，全脂鲜牛乳中沙门氏菌菌落数随温度升高而减少，16株沙门氏菌分离菌株64.0 ℃时可以达到杀菌率100%。在图6 中可知，在脱脂乳中沙门氏菌菌落数也随着温度的升高而减少，16 株沙门氏菌分离菌株在63.5 ℃杀菌率能够达到100%，在脱脂乳中巴氏杀菌效果显著。温度变化对16 株沙门氏菌分离菌株的影响较大，热处理强度不同，其杀菌效效果不同。

图5 全脂乳中不同巴氏杀菌温度对16 株沙门氏菌抑菌效果Fig.5 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in whole milk on 16 strains of Salmonella

图6 脱脂乳中不同巴氏杀菌温度对16 株沙门氏菌抑菌效果Fig.6 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in skimmed milk on 16 Salmonella strains

3 结论

本研究以奶牛场沙门氏菌分离菌株为研究对象，从牛乳生产链中采集700 份样品，分离鉴定出16 株沙门氏菌，检出率为2.29%；血清型鉴定结果显示，分离菌株中有4 种血清型，以甲型副伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌为优势血清型，其次是鼠伤寒沙门氏菌；16 株沙门氏菌分离菌株对杆菌肽和利福平的耐药性高达100.00%，其次是氨苄西林为93.75%，对头孢他啶、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星和青霉素这6 种药物敏感，16 株沙门氏菌分离菌株表现出多重耐药性；共检测到24 种抗生素耐药基因，检出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%）。分离菌株中共检测到12 种不同的毒力基因，检出率最高的是sipA毒力基因，检出率为62.50%（10/16），未检测到ssaR毒力基因。抗消毒剂基因中，除qacG未被检出外，其他4 种基因均有检出，其中qacEΔ1基因检出率最高为56.25%。16 株沙门氏菌对9 种不同种类消毒剂的MIC 值基本都高于厂家推荐使用浓度的1～3倍。巴氏杀菌条件，在64.0 ℃、30 min 时，不管是在全脂乳还是脱脂乳中杀菌率都能达到100%，建议加强对奶牛场中沙门氏菌的防控，严格规范使用抗生素和消毒剂以及加强监督管理牛乳生产链条中卫生质量管理。