CD248负向调控肾细胞癌血流供应

卢 通，宋洪涛，杨力军，秦卫军，杨 发，张嘉煜

(空军军医大学西京医院泌尿外科，陕西 西安 710032)

在2005年之前，肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一种常见且致命的肿瘤类型，缺乏有效的化疗药物。那时，部分患者接受了大剂量的细胞因子治疗，例如白介素2或者干扰素。但这种治疗只有罕见的病例取得一定效果，且产生了严重的免疫风暴，而其他患者的唯一选择是姑息性治疗。2005年，血管生成领域取得重大突破，随后美国食品药品监督管理局批准了第一批口服酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)，即舒尼替尼和索拉非尼，这类药物的作用靶点是血管内皮生长因子受体[1]。RCC作为一种高度血管增生的肿瘤类型，TKIs抗血管治疗很快便投入RCC的临床应用。与接受细胞因子治疗的患者相比，TKIs治疗显著提高了RCC患者的总生存率和无进展生存率，这类药物至今仍是晚期RCC的一项治疗方案[2]。

内皮唾液酸蛋白(CD248)是一种表达于肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤相关周细胞上的单次跨膜糖蛋白，在包括RCC在内的多种肿瘤间质中高表达，具有促进肿瘤血管正常化的作用。已有多篇文献利用CD248-KO小鼠建立肿瘤模型，在结直肠癌中，敲除CD248使小鼠肿瘤中的血管密度显著增加，尤其是新生的小血管[3]，在脑胶质母细胞瘤中发现了同样的现象，黑色瘤也有小血管数量增多的表型。在机制方面，CD248可以直接促进内皮细胞凋亡而促进分支血管选择性退缩，此外还能促进周细胞覆盖新生血管形成的官腔起到稳定作用，CD248通过和两方面发挥促进血管成熟的作用。但是在RCC中，CD248是否仍发挥相同的血管调控作用并没有相关研究报道。本文从临床患者特征入手，首次报道了CD248在调控RCC血管方面可能的作用。

1 对象与方法

1.1 对象

本研究为回顾性研究，将2021年1月20日至7月3日在西京医院泌尿外科就诊的80例RCC患者作为研究对象。纳入标准：年龄12～86岁，临床诊断和术后病理诊断均为RCC。排除标准：已经接受放化疗或者免疫治疗，已经发生肿瘤远处转移，合并其他肿瘤及其他代谢免疫相关疾病。纳入患者共有80例，包括47例男性患者和33例女性患者，年龄13～86(平均55.47)岁。所有患者均处于RCC早期，临床分期为T1～2N0～1M0。大多数患者均为健康体检时发现肿瘤占位，仅有9人表现出不同程度的临床症状，包括腰部疼痛，四肢乏力，夜尿增多。

Endosialin抗体来自Abcam(ab204914)，CD31抗体来自CST(#77699)，DAB显色液来自迈新试剂，患者病理切片由空军军医大学西京医院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色和免疫荧光染色 石蜡切片先在65 ℃烘箱中烘烤3 h，常规脱蜡，逐级水化，3 mL/L H2O2阻断内源性过氧化物酶，非免疫性羊血清封闭。对于免疫组化染色，将片子依次加一抗、二抗，DAB显色，苏木素复染，透明封片。对于免疫荧光染色，将片子依次加一抗、荧光二抗，DAPI染色后封片。

1.2.2 组化染色评级 阳性细胞着色数：每张切片上观察5个高倍视野(200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<1%为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者计分相乘为阳性等级：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.2.3 术中出血量统计 患者手术中全程使用负压吸引器，收集术中流出的血液，手术结束时观察吸引瓶中收集到的血液体积，即为术中出血量。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 10.0软件包处理数据，主要涉及的统计学检验为t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基线资料

本研究纳入的80例RCC患者的中位发病年龄为51～60岁，最小年龄为13岁，这在一定程度上反映了RCC发病的年轻化趋势(图1A)。由于患者术前已在门诊进行了相关检查，一经住院便可尽快手术，其标准住院时间为2周(图1B)。本研究涉及的RCC患者均为肿瘤进展早期，大多数患者并没有表现出特异的临床症状，而是在健康体检时发现肾脏的可疑占位。由于体检单位往往不具备确诊RCC的资质，患者需到上级医院明确诊断，本研究中的患者大多在发现肾脏包块后2个月内就诊(图1C)。

2.2 患者手术资料

本研究纳入的RCC患者均接受了安全有效的手术治疗，仅有1.25%的患者需要术中输血；无术后发热报道，术后平均下床活动时间为3.08 d，平均拔出造瘘管的时间为4.09 d。为了精准管控围术期的风险因素，我们对部分患者进行了基因检测，包括ALDH2、CYP2C19、APOE基因多态性和叶酸。由于近年来腹腔镜手术的广泛开展，西京医院泌尿外科RCC根治术和剜除术的手术总时长在3 h以内，这不仅降低了麻醉风险，同时创伤更小、患者预后更好(图2A)。超过半数的患者术后第1日肾周引流量小于100 mL(图2B)，这意味着患者局部炎症反应较轻，通常可以在术后第3日下床活动。尽管术后患者均有不同程度的中性粒细胞升高，但并没有观察到术后发热情况(图2C)。术后患者肝功能和肾功能变化较小(图2D～F)。

2.3 CD248表达情况

尽管接受手术治疗的RCC早期患者均获得了较好的收益，但不同患者的肿瘤组织差别很大。部分患者的肾肿瘤组织血管极为丰富，这为术中止血带来了较大的困难，增加了手术风险。因此，寻找合适的分子指标来筛选出血风险较大的RCC者，并做好围术期的护理工作尤为重要。为了排除肾癌的不同病理类型所带来的差异，本研究共纳入了5种常见的RCC理类型，包括肾透明细胞癌(64例)、血管平滑肌脂肪瘤(8例)、嫌色细胞癌(4例)、乳头状细胞癌(3例)和嗜酸性细胞腺瘤(1例)。本研究纳入患者的肿瘤直径为1.300～12.200(平均3.756)cm，ISUP核分级为1～3(平均2.062)。

基于课题组的前期研究基础，CD248与血管正常化有关，因此选择CD248作为研究目标。本研究共纳入80例RCC患者，通过免疫组化染色将其分为CD248高表达组(27例，IHC评分≥8分)和CD248低表达组(53例，IHC评分<8分)(图3A～C)。此外，我们发现在RCC中，CD248主要表达在血管周围，提示CD248与血管功能密切相关(图3D)。

2.4 CD248高表达与肿瘤血供不足有关

根据上述结果，本研究检测了患者肿瘤血供相关的指标，发现CD248高表达组患者术中出血更少，相应的术后血红蛋白下降和血浆总蛋白下降也更加轻微(图4A～C)。这表明肾肿瘤高表达CD248时，肿瘤血供相对减少。对肿瘤细胞增殖状态的检测反映了肾肿瘤高表达CD248时，肿瘤增殖相对减少(图4D)，这可能是由于血供不足导致的。对血清VEGF检测表明，高表达CD248的患者具有更高水平的VEGF血清含量(图4E)，推测这可能是肿瘤缺氧导致的一种代偿性上调。

3 讨论

CD248发挥促进肿瘤血管正常化的作用已经在多种肿瘤模型中得到证实，但是在RCC中还没有研究。本研究报道了CD248主要表达在血管周细胞上，同时表达CD248的肾癌患者术中出血的风险更小，这表明高表达CD248时肿瘤血供相对不足，，这将为后续的机制探索提供临床证据。有趣的是，尽管CD248减少了肿瘤的血供，但事实上并未减小肿瘤的体积。研究表明，肿瘤血管密度下降的同时也减少了免疫细胞的浸润，导致肿瘤免疫抑制加重而促进肿瘤进展。因此CD248是否通过血管调控肿瘤免疫是十分具有前景的研究方向。

近年来，免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)治疗走入人们的视野[9]。RCC是一种高度免疫浸润、高度免疫抑制和高度血管增生的癌症类型。因此， ICB治疗一直被认为是RCC，尤其是晚期RCC的核心疗法，这一点已经被写入2022年欧洲泌尿外科协会发布的关于肾透明细胞治疗的指南之中。2018年，美国食品药品监督管理局批准了第一批PD-1抗体——伊匹单抗和纳武单抗，两者很快投入临床使用并取得了令人惊喜的效果。尽管ICB可以为免疫治疗应答者提供长久的获益，但仍有超过50%的患者对ICB治疗是耐药的。因此近年来涌现出了多种联合治疗方案，以期提高ICB治疗的反应性，包括多种ICB抗体的联合应用、与TKIs的联合应用、与立体定向放射治疗的联合应用等。一项针对晚期RCC的3期临床试验指出，TKIs与PD-1抗体pembrolizumab的联合治疗效果，要优于sunitinib的单药治疗且没有产生更多的不良反应。尽管在本研究中并未涉及肿瘤免疫，但CD248对血管的影响提示，抗CD248的抗体似乎很适合与ICB治疗联用，以提高ICB治疗的反应性。

关于ICB治疗的获得性耐药机制目前仍不清楚。RCC是具有高度异质性的肿瘤类型，即使在同一种病理类型中，在肿瘤微环境的细胞成分和分子特征上，也表现出显著的患者间变异，这种改变被认为影响了肿瘤进展和ICB治疗抵抗。因此，筛选RCC更有效的治疗靶点或者寻找反应预测标志物显得尤为重要。综上所述，我们认为，CD248可能是预测ICB治疗是否具有反应性的一个潜在的标志物，在后续的研究中我们将展开探索。