CD147抗体对肺间质纤维化小鼠体内Treg细胞的影响

王苗庆，张明阳，陈 若，冯 转，耿杰杰

(空军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，陕西 西安 710032)

肺间质纤维化是一种严重的进行性疾病，以细胞外基质过度积累、肺结构重塑为特征，是类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的严重并发症[1]。本课题组前期研究已证实CD147抗体可以减弱博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的肺间质纤维化进程，这可能是一种潜在治疗肺间质纤维化的方法[2]。调节性T(regulatory T，Treg)细胞参与多种自身免疫性疾病的发生和发展过程，是一种稳定的细胞谱系，在维持免疫耐受和免疫稳态中起着抑制作用[3]。自然产生的CD4+CD25+Treg细胞通过抑制CD4+和CD8+T细胞来调节免疫应答[4]。在肺间质纤维化的相关研究中，特别是基于急性肺损伤和肺间质纤维化的动物模型的研究，Treg细胞的作用一直存在争议。有研究表明，Treg细胞的耗竭会加快肺间质纤维化的进程[5]，而另一些研究表明，Treg细胞的耗竭会减缓肺间质纤维化的发展进程，并且用Treg细胞治疗可以缓解肺损伤[6-7]。这些相互矛盾的结果表明，Treg细胞在肺间质纤维化中的作用仍不明确。在本次研究中我们通过BLM诱导肺间质纤维化小鼠模型，证实随着小鼠肺间质纤维化程度加重，无论在肺组织还是肺泡灌洗液中，Treg细胞的数量都会逐渐增加，而CD147抗体可通过降低Treg细胞的数量来减缓小鼠肺间质纤维化的进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性C57BL/6小鼠，9～11周龄，平均体质量(18.5±0.5)g，购自空军军医大学实验动物中心(许可证号：2021-NTSCMM-001)。

1.1.2 主要试剂 BLM粉针剂(15 mg/支，日本化药株式会社)；戊巴比妥钠(西安科昊生物工程有限公司)；FITC标记抗小鼠CD4单抗、APC标记抗小鼠CD25单抗、PE标记的抗小鼠Foxp3单抗、抗小鼠CD147单抗(美国Biolegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺间质纤维化小鼠模型的建立 将12只C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组(n=3)和BLM组(n=9)。12只小鼠腹腔注射8.0 g/L戊巴比妥钠(80 mg/kg)进行麻醉。将小鼠仰卧固定在实验台上，颈部用乙醇消毒后逐层暴露气管，用100 μL的微量加样器抽取BLM溶液，经气管软骨环间隙朝心端刺入气管，回抽见空气无阻力后，将药液注入气管，药量为5.0 mg/kg。注入过程中将小鼠直立、旋转，使药液在肺内分布充分且均匀。给药完成后，缝合颈部切口，用乙醇消毒。生理盐水组小鼠气管内注射相同剂量的生理盐水。待动物自然清醒后放置恒温净化饲养系统内常规饲养，并分别在第3、7、14日处死3只生理盐水组小鼠、3只BLM组小鼠进行病理分析。将BLM组6只小鼠随机分为CD147抗体治疗组(n=3)和IgG对照组(n=3)，对于CD147抗体治疗组小鼠，造模次日起腹腔注射10 mg/kg CD147抗体1次，IgG对照组小鼠给予1次相同浓度的IgG。

1.2.2 病理组织学观察 剪取小鼠左上肺组织块置于40 mL/L多聚甲醛中固定24 h，经脱水、石蜡包埋后，制作石蜡切片(厚度3 μm)，HE染色观察肺组织炎症水平，Masson染色观察肺组织纤维化情况。

1.2.3 流式检测细胞数量 取小鼠肺组织研磨消化后，加入5 mL红细胞裂解液，冰上裂解10 min后，再加到5 mL小鼠淋巴细胞分离液(Mediatech公司)上层，2 000 r/min，离心20 min。吸取中间层的单核、淋巴细胞，分别用FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3标记，室温放置0.5 h，磷酸缓冲盐溶液洗3遍，流式检测。

2 结果

2.1 BLM诱导的肺间质纤维化小鼠模型的建立

HE染色结果显示，随着时间的延长，小鼠肺间质纤维化程度逐渐加重。第3日，小鼠肺部病变较轻(图1A)；第7日，小鼠病变肺叶呈粉白色，有明显肿胀，可见散在点状出血。镜下观察肺间隔增宽明显，炎症反应加重，有大量淋巴细胞、少量单核-巨噬细胞浸润，偶见中性粒细胞(图1B)；第14日，小鼠病变肺叶间隔增宽更为明显，肺泡腔及间质内仍有大量淋巴细胞浸润，单核-巨噬细胞的浸润量增加，偶见中性粒细胞(图1C)。Masson染色结果显示随着BLM诱导时间的增加，胶原纤维沉积逐渐增加(图1D～F)。

2.2 Treg细胞在小鼠肺间质纤维化进程中的变化

为了观察Treg细胞在小鼠肺间质纤维化过程中的变化，我们在BLM诱导小鼠肺间质纤维化过程中，将第3、7、14日小鼠的肺进行灌洗，之后将肺取出研磨消化，把分离出来的细胞进行Treg细胞流式检测。与生理盐水组相比，BLM组小鼠肺组织中的Treg细胞在第7日和第14日显著增加(P<0.05，图2A)，肺泡灌洗液中的Treg细胞在第7日(P<0.05)和第14日也明显增多(P<0.01，图2B)。这说明小鼠肺间质纤维化可能与Treg细胞相关。

2.3 CD147抗体治疗小鼠肺间质纤维化

为了观察CD147抗体对小鼠肺间质纤维化的治疗效果，CD147抗体治疗组小鼠在BLM诱导第2日起用CD147抗体在BLM注射后第14日对肺组织进行切片染色。HE染色发现，IgG对照组小鼠病变肺叶间隔增宽明显，肺泡腔及间质内有大量淋巴细胞、单核-巨噬细胞及少数中性粒细胞浸润(图3A)；大量成纤维细胞聚集在间质及小支气管周围，胶原纤维明显增多，难见到正常的肺组织结构(图3B)。CD147抗体治疗组小鼠肺间质炎症明显减轻(图3C)，间质内及小支气管周围胶原纤维沉积减少(图3D)。

2.4 CD147抗体治疗小鼠肺间质纤维化后Treg细胞的变化

流式检测BLM诱导第14日IgG对照组及CD147抗体治疗组肺组织和肺泡灌洗液中Treg细胞数量。与IgG对照组相比，CD147抗体治疗组小鼠的肺组织中Treg细胞数量显著减少[(8.047±0.878)vs(5.350±0.378)，P<0.05,图4]，肺泡灌洗液中Treg细胞数量也显著降低[(3.280±0.917)vs(2.623±0.204)，P<0.05,图5]。这说明CD147抗体可能通过影响Treg细胞的数量来减轻小鼠肺间质纤维化的病情。

3 讨论

肺间质纤维化可由化学物质、辐射、纤维原性环境毒素、自身免疫病或其他未知因素引发，其发展涉及一系列事件，包括损伤、炎症、修复和调节障碍[1,8]。呼吸困难是临床最常见的肺间质纤维化症状，大多数肺间质纤维化患者在出现症状后3～8年内出现进行性呼吸衰竭[9]。肺间质纤维化的发病机制已被广泛研究，但寻找治疗干预途径仍是一个挑战[10]。

Treg细胞是CD4+T细胞的一个亚群，高表达细胞表面标记CD25，并表达核转录因子Foxp3，该转录因子对Treg细胞的免疫抑制功能至关重要[11]，因此，Treg细胞能够抑制过度有害的炎症过程，通过维持免疫稳态来防止免疫病理反应的发生[12]。在肺间质纤维化中，Treg细胞并不是越多越好。肺间质纤维化患者外周血中活化的CD4+T细胞数量与临床预后呈负相关[13]，而在人类和啮齿类动物肺间质纤维化进程中Treg细胞数量与疾病的恶化程度呈正相关[14]。硫唑嘌呤是嘌呤类似物的免疫抑制剂，可用于治疗多种自身免疫病，而在硫唑嘌呤治疗肺间质纤维化的多中心临床试验中经治疗的住院人数和死亡率均增加[15]，究其原因可能是由于硫唑嘌呤可上调Treg细胞的数量[16]。这些结果均提示Treg细胞对肺间质纤维化患者有负面影响。而我们的实验结果也证实了Treg细胞的数量确实与小鼠肺间质纤维化的恶化程度呈正相关，这为基于Treg细胞治疗肺间质纤维化的方法提供了可靠的理论依据。

我们前期的研究证明CD147抗体可以通过平衡Th17和Th1细胞之间的关系来减弱BLM诱导的肺间质纤维化的过程[2]。在本实验中我们发现CD147抗体治疗后，肺中的Treg细胞减少，进一步减缓了肺间质纤维化的进程。因此，CD147可能是一种潜在的治疗肺间质纤维化的靶点。