不同种属骨颗粒腔隙结构Micro-CT三维可视化表征方法

朱 瀛 解茹越 张合虎 高 冰 刘 贤 韩鲁佳

(中国农业大学工学院， 北京 100083)

0 引言

肉骨粉是对养殖动物屠宰场、肉品加工厂产生的新鲜无变质动物骨骼及废弃组织经高温高压蒸煮、灭菌、脱胶、干燥粉碎后的一种重要的动物蛋白产品，其粗蛋白质量分数一般在40%～60%，氨基酸组分相对比较平衡，但品质变异较大。疯牛病，又称为牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)，属一类人畜共患传染病。科学研究表明，疯牛病的引发和传播是因食用携带朊病毒的牛羊源类动物肉骨粉所致，自1985年英国首次发现以来，受到疯牛病牵连的国家多达100多个，造成了巨大的经济损失和社会恐慌[1]。鉴于此，世界各国均严格禁止在反刍类动物饲料中添加肉骨粉[2-4]。因此，饲料中肉骨粉的检测方法学研究一直是世界各国饲料安全领域的重点任务之一。

目前，肉骨粉的检测方法主要有：显微镜法[5]、聚合酶链反应(PCR)法[6]和近红外光谱分析(NIRS)法等[7-11]，其中显微镜法检测标准在1998年由欧盟颁布实施并持续改进至今，一直被用作确证检测，应用十分广泛。肉骨粉显微镜检测方法的基本原理是基于陆生和水生等不同来源肉骨粉颗粒腔隙等微观结构形态特征的不同进行人工显微镜观察和判别，其突出优势是检测精度高，但肉骨粉显微镜检测时待测样品需经严格干燥、粉碎、筛分、沉淀和悬浮物提取、染色、玻片制备等复杂、耗时的前处理，且显微镜肉眼观察高度依赖检测人员的专业技能水平。

显微X射线计算机断层成像(X-ray micro-computed tomography，Micro-CT)是一种先进的、非破坏性的3D成像技术，其成像原理是微焦点X射线球管发出的锥形X射线束透过样本时，样本各部位密度差异导致对X-射线吸收率不同从而在X-射线检测器上呈现出不同的结构信息，对样本进行360°成像后通过计算机软件将每个角度的图像进行重构还原成计算机可分析的3D图像。与普通CT不同，Micro-CT空间分辨率极高，通常达到微米级，因而具有良好的“显微”效果。 Micro-CT在无需对样本进行破坏性预处理的情况下，原位、三维可视化地表征样本的内部显微结构，已在医学[12-14]、地质[15-18]、材料[19-21]和农业[22-25]等多个领域得到研究与应用。

研究表明，Micro-CT的X射线被吸收的总量取决于它穿透物质的密度、原子组成以及X射线束的光能频谱，在X射线能量一定的情况下，密度大的物质对射线的衰减更大[26-28]。骨与骨腔隙因构成不同存在一定的密度差异，骨与其腔隙Micro-CT的X射线吸收或衰减也会有所不同，理论而言，使用Micro-CT进行肉骨粉骨颗粒微观形貌的分析是可行的。然而，骨颗粒腔隙通常会附着一些脂肪、蛋白质等物质，这些物质的密度介于骨与骨腔隙之间，因此在使用Micro-CT进行分析时，需辅以机器学习算法进行图像阈值分割处理才能准确获取骨颗粒内部显微结构特征信息。

为了探究使用Micro-CT原位、三维、可视化表征肉骨粉中骨颗粒显微结构特征信息的可行性，本文以水生(鱼骨)和陆生(牛、猪、鸡)动物源骨颗粒为对象，开展基于Micro-CT的水生和陆生动物源肉骨粉颗粒的显微结构分析研究，以期为建立饲料中不同动物源成分的快速分析方法提供技术支撑。

1 表征方法

1.1 不同动物源肉骨粉及其骨颗粒样品

研究所用不同动物源肉骨粉源于笔者所在实验室动物源饲料样品库，样品均为避光密封4℃恒温保存。其中，鱼粉、牛骨粉、猪骨粉和鸡骨粉分别采自黑龙江省、山东省、江苏省和河北省相关企业。

从上述每种肉骨粉样品中分别随机选取10个骨颗粒用于Micro-CT扫描和重构条件优化，随后再从中各随机选取3个骨颗粒用于图像分割方法的比较和原位三维可视化和断层结构表征。

1.2 分析仪器

德国徕卡公司DM 2500型生物显微镜，配备DFC420C型CCD摄像头和Leica Application Suite V3.30专用图像分析软件。

比利时Bruker公司Skyscan 1275型Micro-CT，电压范围20～100 kV，最大功率为10 W，360°扫描，空间分辨率6～50 μm，配置3MP(1 944像素×1 536像素)有源像素平板探测器。

1.3 不同动物源肉骨粉样品的显微镜分析

按照饲料中动物源性成分检测显微镜法[29]，对不同动物源肉骨粉样品进行沉淀、脱脂、染色、风干、制片预处理，然后显微镜观察，获取不同动物源骨颗粒样品的显微镜图谱，用作不同种属肉骨粉骨颗粒样品显微结构基准。

1.4 基于Micro-CT的不同动物源肉骨粉骨颗粒显微结构的原位、三维可视化表征方法

1.4.1Micro-CT扫描条件优化

使用Bruker Skyscan 1275型Micro-CT，对上述不同动物源肉骨粉样品进行扫描。扫描前，无需任何预处理，直接用石蜡将样品固定在仪器圆形载物台上，避免扫描过程中晃动。

鉴于电压和电流是影响扫描图像质量的重要因素，将颗粒样品分别在50 kV/200 μA、80 kV/125 μA和100 kV/100 μA的条件下进行扫描，根据扫描时X射线透过率的最大、最小和平均值，确定最优扫描电压和电流为80 kV、125 μA。

1.4.2Micro-CT数据采集及数据去噪

Micro-CT数据采集采用360°扫描、图像分辨率8 μm、旋转步长0.20°、图像2帧取平均(即扫描过程中样品每旋转0.20°获取2帧图像取平均计算)、曝光时间46 ms。

通过调整软件Ring-Artifacts值(分别设置为1、2、3、4和5后进行图像预览)进行环形伪影消除，使用软件Beam-hardening Artifacts进行杯状伪影校正(分别设置为10%、20%、30%、40%和50%后进行图像预览)。调整软件Smoothing值(分别设定为0、1、2、3和4后预览图像)和Post-Alignment值(分别设定为-1.0、-0.5、0、0.5和1.0后预览图像)以减少扫描过程中样品轻微晃动可能导致的重构图像出现偏差。通过预览比较获取的图像效果，Micro-CT图像重构条件确定为：Ring-Artifacts 3，Beam-hardening 30%，Smoothing 1和Post-Alignment 0。

1.4.3Micro-CT图像三维重构算法

使用Skyscan NRecon软件(Bruker Skyscan,比利时)对Micro-CT图像进行三维重构。所有样品图像均在X射线吸收系数为0～0.062的范围内进行重构，得到的灰阶为0到255的8位BMP图像。

分别采用简单全局分割法(Global)[30-31]、自适应全局分割法(Otsu)[32]、K-means全局聚类分割法(K-means)以及局部均值自适应均值分割法(Adaptive mean-C)和局部中值自适应分割法(Adaptive median-C)[33]进行图像分割与参数优化。

经预试验，采用Global计算时，将样品所有重构图像(80幅)阈值统一设定为100进行二值化处理；Otsu算法则据每幅图像分别进行计算自动获取阈值，阈值变化范围为94～103。

使用Matlab 2019软件中的自适应阈值(Adaptive threshold)函数对样品图像进行计算。采用控制变量法对自适应分割法函数中的局部运算区域(WS)和修正值(C)的选取进行优化，具体如下：固定WS为5，分别设定C为-2、-1、0、1、2对各样品重构后的图像进行处理，对结果进行分析，同理固定C为0，分别设定WS为1、3、5、7、9对图像进行处理并分析。

1.4.4骨颗粒显微结构原位可视化

采用优化后的阈值分割参数对各样品重构图像进行二值化处理，将获取的二值化图像导入CT Vox软件和DataViewer软件中，分别获取三维显微结构图像和显微断层结构图像。图像中骨结构渲染为红色、腔隙结构渲染为黑色。

2 结果与讨论

2.1 不同动物源肉骨粉的显微镜图谱

经显微镜检测获得的不同种属肉骨粉骨颗粒显微镜图像如图1所示。

图1 不同动物源骨颗粒显微镜检测成像结果Fig.1 Microscopic imaging results of bone particles from different animals

由图1可以看出，鱼骨颗粒呈细长管状，边角锐利，黑色骨腔隙呈细长型分布于骨颗粒中间。牛骨、猪骨、鸡骨颗粒为不规则多边体，黑色腔隙呈椭圆形。由此可知，鱼骨与牛骨、猪骨和鸡骨在整体轮廓和骨腔隙形状上有明显差异，这也是可通过显微镜检测的方法进行水生和陆生动物源肉骨粉判别的主要依据。

2.2 基于不同图像阈值分割方法的Micro-CT图像比较

图2为经不同阈值分割方法处理不同动物源骨颗粒样品的Micro-CT断层成像变化，其中Global法阈值设定为100，Otsu法阈值根据每幅图像自动获取，Adaptive median-C法预设WS为5、C为0，K-means法设置分类数为3。

图2 经不同阈值分割算法处理不同动物源骨颗粒的Micro-CT断层图像Fig.2 Micro-CT tomographies of different bone particles processed by different threshold segmentation algorithms

由图2可知，采用2种全局阈值分割法(Global和Otsu)获取的二值化图像结果较为相近，其结果仅呈现出了骨颗粒的基本轮廓，并无任何腔隙结构信息。采用K-means法获取的灰度图像是依据原始图像各像素点的灰度将图像分为3类，分别为背景、骨颗粒外轮廓和骨颗粒内部，但骨颗粒内部图像无腔隙结构特征。由此可知，骨颗粒内部由于有骨腔隙结构存在的整体灰度低于外轮廓，但颗粒内部区域灰度较为相近，仅通过设定单一的全局阈值无法获取骨腔隙的结构特征。而经2种局部阈值分割法处理的成像中则呈现出了较多的骨腔隙信息，这是由于该类方法是基于样品图像中每个像素点周围的区域进行计算，故这类被脂肪等物质包裹的体积较小的骨腔隙，由于其平均密度小于区域内的骨结构密度，依然会被定义为腔隙结构。对比2种局部自适应分割法结果，可以看出采用Adaptive mean-C法获取的图像与原始图像中的部分腔隙结构差距较大，且结果图像中骨颗粒的边缘出现多处开口现象，这也与颗粒实际情况不符，而Adaptive median-C法处理的图像结果与原始图较为相近，适合作为骨颗粒腔隙特征的表征方法。同时需要进一步讨论该方法中的WS和C 2个参数对图像结果的影响。

采用Adaptive mean-C法的参数优化结果如图3所示(从上到下4幅图像依次为鱼骨、牛骨、猪骨、鸡骨)。由图3可知，Adaptive mean-C函数中C修正的是骨腔隙半径，当C由0逐渐减小时部分体积较小的腔隙会消失，而当C逐渐增大时，部分距离相近的腔隙会发生连通现象。同时，函数中的WS影响的是局部阈值计算区域的尺寸。可以看出，当WS值过小时，结果逐渐趋近于全局阈值分割的图像，当WS值过大时，骨腔隙的半径会偏大，甚至一些距离较近的腔隙会连接在一起。对照图1，优化的Adaptive mean-C法表征骨颗粒腔隙特征的参数WS为5，C为0。

图3 基于Adaptive mean-C阈值分割算法的不同动物源骨颗粒成像结果比较Fig.3 Results of different bone particles pictures dealt with different parameters of Adaptive mean-C method

2.3 不同动物源骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维可视化表征结果

图4～7所示为4种不同动物源骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维可视化表征和沿z轴由下至上的5个x-y断层图像结果。

由图4可以看出，鱼骨样品呈细长管状，断层鱼骨的黑色骨腔隙均沿骨颗粒中间呈细长状分布，此为中国农业行业标准NY/T 3002—2016[29]以及图1显微镜图像所示的鱼骨的典型结构特征。由图5～7可知，牛、猪和鸡骨颗粒样品断层均呈现为不规则多边体，其腔隙结构多呈不规则分布于骨颗粒内部，这也与相关标准和显微镜图像所呈现的骨颗粒及其腔隙结构和分布具有较好的一致性。上述结果表明，采用Micro-CT方法，无需进行显微镜检测所需的繁琐的样品预处理，直接通过观察样品腔隙结构特征的不同，即可实现对水生和陆生动物源肉骨粉的有效鉴别。

图4 鱼骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维断层可视化表征结果Fig.4 Micro-CT 3D in-situ visualization of fish bone particles

由图5～7还可看出，牛、猪和鸡骨腔隙结构分割精度还有待进一步提高。下一步研究将采用其它深度学习算法，以期实现对不同动物源骨颗粒腔隙结构的精准分割，提高不同种属骨颗粒腔隙形态结构的Micro-CT原位三维可视化表征的精度。

图5 牛骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维断层可视化表征结果Fig.5 Micro-CT 3D in-situ visualization of bovine bone particles

图6 猪骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维断层可视化表征结果Fig.6 Micro-CT 3D in-situ visualization of porcine bone particles

图7 鸡骨颗粒显微结构的Micro-CT原位三维断层可视化表征结果Fig.7 Micro-CT 3D in-situ visualization of chicken bone particles

3 结论

(1)建立了一种基于Micro-CT和Adaptive mean-C图像分割算法的不同种属肉骨粉骨颗粒腔隙结构三维原位可视化表征方法。

(2)优化扫描条件为电压80 kV、电流125 μA、图像分辨率8 μm、旋转步长0.20°、曝光时间46 ms和360°扫描；优化图像三维重构条件为Smoothing 1、Post-Alignment 0、Ring-Artifacts 3和Beam-hardening 30%。

(3)优化Adaptive mean-C函数参数为WS为5，C为0。基于Micro-CT的骨颗粒显微形态结构表征结果与显微镜检测结果较为一致。研究结果为丰富水生和陆生动物源饲料的快速、无损判别分析提供了技术支撑。