基于全二维气相色谱-四级杆飞行时间质谱高通量检测青花椒挥发性香气成分

向章敏，刘恩刚

(1.广东省科学院测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广州 510070；2.贵州大齐岭生态农业有限公司，贵州 铜仁 555101)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)作为“八大调味品”之一，是一种我国特有且资源丰富的调味品及中药原料，具有特殊麻感和浓烈香味[1]。青花椒(Zanthoxylumarmatum)来源于芸香科植物青椒树的干燥成熟果皮，是我国种植面积最大的花椒种属之一，也是老百姓生活中最常用的食用香辛料[2]，其中的香气自然就成为评判其品质优劣的重要指标。青花椒中的香气物质是能对人的嗅觉(气味)产生刺激而获得某种感觉的物质，带给食品芳香的气味，是评价花椒质量和特色的重要指标[3]，同时青花椒中的挥发性有效成分具有温中行气、逐寒、止痛、杀虫、抗肿瘤、麻醉等功效[4]。因此，检测青花椒挥发性香气物质显得尤为重要。目前，一维气相色谱是检测花椒香气成分最常见的分析方法，如王花俊等[5]利用气相色谱-质谱法对不同提取方法获得的花椒挥发性香味成分进行了检测与分析；魏泉增等[6]采用气相色谱-质谱法分析了5个不同产地花椒挥发性成分；蒲凤琳等[7]用水蒸气蒸馏结合气相色谱-质谱法分析比较了四川汉源青、红花椒挥发性香气成分；Sun等[8]采用香气萃取稀释结合气相色谱-质谱联用技术与气相色谱-嗅觉法鉴定了四川汉源和陕西韩城两个地区的花椒油中的主要香气活性化合物。然而，一维气相色谱往往出现峰容量不足、峰共流出、物质干扰严重等问题，很难实现高通量色谱分离与准确鉴定。全二维气相色谱由于实现了将分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以正交方式相组合，极大地提高了色谱的分离能力和分析速度，弥补了传统一维气相分离峰容量不足的缺点，是实现高通量复杂成分色谱分离的强有力工具[9]。因此，本文基于顶空固相微萃取与全二维气相色谱-四级杆飞行时间质谱相结合的方法，建立了一种高通量检测青花椒挥发性香气成分的分析方法，该方法简单、快速、准确地实现了青花椒香气成分检测，为青花椒香味客观评价、风味产生机理、质量品质分析等相关领域的研究提供了科学方法和物质基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890B-7250气相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪 美国Agilent公司；SSM1800固态热调制器 雪景科技公司；PAL RSI120三合一自动进样器 瑞士CTC公司；FW80研磨仪 天津泰斯特仪器有限公司；ND100-1氮吹仪 杭州瑞诚仪器有限公司；AL-104电子天平 美国Mettler-Toledo公司；ZNHW-Ⅱ电热套 巩义市予华仪器有限责任公司；其他常用玻璃仪器。

甲醇、正己烷：色谱级，美国Merck公司；无水硫酸钠：分析纯，广州化工集团有限公司；超纯水：自制；正构烷烃标准品：C10～C25，纯度>99.5%，Sigma-Aldrich Fluka公司；内标乙酸苯乙酯：纯度>99.6%，Sigma-Aldrich Fluka公司。

1.2 样品材料

试验样品由贵州大齐岭生态农业有限公司提供。样品分别来源于贵州石阡县、云南昭通市和四川泸县，品种均为九叶青花椒。

1.3 仪器分析条件

气相色谱条件：色谱柱组合为HP-WAX(5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm，0.25 μm)和DB-17MS(50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷，1.0 m×0.180 mm，0.18 μm)；进样口温度为250 ℃；不分流进样；程序升温为50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃并保持3 min；恒流模式，载气为氦气，流速为1.0 mL/min。

调制器条件：冷区温度设置为-50 ℃，进入热区和离开热区的温度相对于柱温为偏差+30 ℃和+120 ℃，两个热区的上限温度均为320 ℃；调制周期为4 s。

质谱条件：离子源为 EI,70 eV；离子源温度为200 ℃；四级杆温度为150 ℃；传输线温度为280 ℃；质量范围为45～400 m/z；采集速率为50 Hz。

1.4 前处理方法

本文采用顶空固相微萃取(HS-SPME)方法对青花椒挥发性香气成分进行前处理[10-11]。将样品在冷冻干燥后研磨成粉状，过60目筛，随后称取0.0500 g粉末置于20 mL顶空样品瓶中，同时加入一定量的乙酸苯乙酯内标，用顶空瓶盖将其密封，然后将顶空瓶放入固相微萃取装置中加热，在60 ℃条件下平衡20 min，利用固相微萃取纤维头(PDMS/DVB/CAR)吸附20 min，最后在250 ℃进样口解吸5 min进行全二维气相色谱分离。

1.5 数据处理方法

化合物定性鉴定是与NIST标准谱库(NIST/EPA/NIH 2017)进行匹配，选择正、反匹配因子均高于800的化合物，同时使用保留指数和精确质量数对化合物作进一步确认[12-13]。定量方法是根据内标相对含量进行半定量分析[14]。采用Canvas(V1.8.0，J & X Technologies)数据处理软件进行全二维数据处理。

2 结果与讨论

2.1 全二维色谱分离效果

全二维气相色谱技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC)由于实现了分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以正交方式相组合的色谱分离模式，极大地提升了色谱的分离能力和分析速度，弥补了传统一维气相分离峰容量不足的缺点，是实现高通量检测的强有力工具[15]。因此，色谱柱的组合是实现正交分离的关键因素，直接影响复杂化合物的分离效果。对于大多数香气物质分析而言，一维色谱柱通常为极性柱，组分会依据极性顺序出峰，二维色谱柱为中等极性或弱极性柱，组分会按照挥发性及官能团顺序出峰。本文选择了HP-WAX极性柱作为第一维色谱柱，选择DB-17中等极性柱为第二维色谱柱，其全二维色谱分离结果见图1。

图1 青花椒挥发性香气成分的全二维气相色谱图

由图1可知，一维气相色谱(one-dimensional gas chromatography，1-DGC)分离存在部分共流出现象。由图1选中的区域可以看出，1-DGC仅检测到2个峰，分别为大根香叶烯和γ-古芸烯，而GC×GC在相同保留时间上进一步分离之后又得到另外3个峰，分别是柠檬醛、橙花醇乙酸酯、4-(3,4-二甲氧基苯基)-4-哌啶醇。因此，由1-DGC和GC×GC分离对比可以看出，GC×GC的正交分离可使得色谱峰容量极大地提高，从而实现青花椒挥发性香气物质的高通量检测，其中包括文献[16-17]在1-DGC分析中未报道的微量成分。此外，对于性质类似的有机化合物一般都具有相同的化学结构，如相同的化学基团、芳香环、双键等，在全二维气相色谱分离中，可以实现对同系物、异构体、同类组分等族分离效果。本文对不同萜类物质分析过程中，发现单萜、倍半萜及含氧萜类在全二维色谱图上具有较好的族分离效果，见图2。

图2 萜类物质族分离效果图

由图2可知，单萜、倍半萜及含氧萜类在全二维色谱上具有较好的族分离效果，其中根据挥发性，单萜出峰时间相比含氧萜烯和倍半萜要快。其次，从极性来看，含氧萜烯比单萜和倍半萜略强一些，所以在二维柱上会比单萜和倍半萜略为靠近下端。因此，本文所使用的色谱柱组合对青花椒香气成分中的萜类物质具有较好的族分离效果。

2.2 定性和定量分析

基于1.5的数据处理方法，采用NIST库检索，筛选正向、反向匹配度均大于800的化合物，然后通过分子离子峰的精确分子量以及实测保留指数做进一步化合物结构确认，最终定性鉴定出了75个化合物，并采用乙酸苯乙酯内标相对含量定量方法，对贵州、云南及四川3个地区的实际样品进行检测分析，其分析结果见表1。

表1 青花椒挥发性香气成分定性和定量数据

续 表

由表1可知，本文共分析鉴定了青花椒中75种主要挥发性香气化学成分。从定性数据来看，正向、反向匹配因子均大于800，平均值分别为842和851；保留指数经与文献比对，偏差值均不超过40；高分辨分子量检测值与理论值偏差均小于5。综上，青花椒中75种化合物的定性鉴定结果准确、可靠，符合定性分析要求[18]。

2.3 实际样品分析

本文采集了不同地区的青花椒样品进行实际样品分析，以乙酸苯乙酯为内标，采用1.4方法对所鉴定的75种青花椒挥发性香气成分进行半定量分析，各地区相对含量分析见表1。定量分析结果表明，青花椒中主要的挥发性香气物质为芳樟醇，平均占总挥发性成分的87.2%以上，其相对含量大小顺序为贵州(25.29 mg/g)>云南(12.96 mg/g)>四川(8.58 mg/g)。另据文献报道[19]，芳樟醇具有浓青带甜的木青气息，似玫瑰木香气，既有紫丁香、铃兰香与玫瑰的花香，又有木香、果香气息，香气柔和，轻扬透发，对青花椒香气贡献较大。其次，从化学结构来看，青花椒中挥发性香气成分类型主要为萜类物质，其中包括单萜类、倍半萜类及含氧萜类，不同地区萜类物质含量比较见图3。

图3 不同地区青花椒样品萜类物质含量

由图3可知，萜类物质在不同地区的含量趋势是一致的，其相对含量大小顺序为单萜类>含氧萜类>倍半萜类，贵州地区的萜类物质含量高于云南和四川。其次，除了比较芳樟醇及萜类物质含量外，本文也对其余含量相对较高的10种物质进行了比较，其比较结果见图4。

图4 青花椒主要香气成分的比较

由图4可知，除芳樟醇外，其他相对含量较高的香气成分依次为β-月桂烯、柠檬烯、β-罗勒烯、4-侧柏醇、β-水芹烯、桧烯、侧柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯，这些成分占挥发性物质总量的90%以上。根据不同地区主要挥发性香气物质的含量分析来看，β-月桂烯、β-罗勒烯、4-侧柏醇、侧柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯在贵州地区含量较高，β-水芹烯、桧烯在四川地区含量较高，柠檬烯在贵州和四川地区含量相当，侧柏烯、γ-萜品烯在云南和四川地区含量相当。综上，针对本次分析样本，贵州青花椒香气成分总量高于云南和四川。

3 结论

本文基于全二维气相色谱-四级杆飞行时间质谱方法建立了青花椒挥发性香气成分的高通量分析方法，并应用于实际样品分析。与常规的一维气相色谱相比，解决了部分峰共流出的问题，并实现了青花椒中萜类香气物质全二维族分离效果。此外，本文对来自贵州、云南和四川的青花椒样品进行检测与分析，共鉴定出75种主要的香气化学成分，并通过乙酸苯乙酯内标进行相对含量分析，发现青花椒中的主要挥发性香气物质为芳樟醇，平均占比可达87.2%，其次是β-月桂烯、柠檬烯、β-罗勒烯、4-侧柏醇、β-水芹烯、桧烯、侧柏烯、γ-萜品烯、α-蒎烯等萜烯类物质，且在不同地区，其含量占比略有差异。本研究为青花椒香味品质分析、物质基础解析、综合利用等相关领域提供了科学方法和数据参考。