响应面优化山桐子油制备共轭亚油酸的工艺研究

蒋海艳 ，庞贵尹，郭晓强，陈联梅，康泰然

(成都大学 食品与生物工程学院，成都 610106)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim.)，又名椅桐、水冬瓜、油葡萄等，含油率高，是一种被称为“空中油库”的可再生能源。我国已广泛种植山桐子，其主要分布在陕西、甘肃、河南三省的南部和中南二省、华东六省、华南二省及西南三省等省区。在四川省主要分布在川北、川西、川南盆周山区，其次是川东地区。山桐子耐高温、忌积水、喜光、产果量高，树龄100年左右仍可产果[1]，生长周期长，果实产出率高，富含不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量较高，其次含有少量维生素E、甾醇、酚类等功能性成分[2]。

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是亚油酸(linoleic acid, LA)的位置异构体和几何异构体的共轭双键混合物，其中两种异构体(9c, 11t-和10t, 12c-)具有生物活性[3]。共轭亚油酸具有预防和治疗许多疾病的功能，对肥胖、癌症、动脉粥样硬化、炎症等方面的疾病具有一定的积极作用[4-7]。天然共轭亚油酸主要来自反刍动物，如肉类、牛奶和乳制品，虽然分布广泛，但是含量极少，不足以达到40～42 mg/kg(体重)的推荐摄入量[8]。共轭亚油酸作为“21世纪新型营养素”，广泛应用于保健食品、新型食品防腐剂、食品添加剂等方面[9]。现有研究如共轭亚油酸减肥制剂或软胶囊可抑制脂肪细胞热量、调整新陈代谢等，共轭亚油酸乳制品可用于提高乳制品的功能性，共轭亚油酸作为家禽、牲畜饲料的添加剂可用于生产出共轭亚油酸含量高的功能性产品，展示出了共轭亚油酸的重要应用价值[10-12]。因此，开展以山桐子油为原料制备共轭亚油酸新工艺的研究在食品及食品添加剂和食品保健品等领域均具有重要的意义。

目前主要以红花籽油、大豆油等草本植物油为原料制备共轭亚油酸[13]。我国已出台支持木本油料发展的相关政策[14]，山桐子油作为木本植物油市场潜力巨大。然而，关于山桐子油的基础研究较少。我们以山桐子油为原料，探索制备共轭亚油酸的新工艺。在单因素试验基础上结合响应面分析技术对制备共轭亚油酸工艺进行优化，应用微波辅助加热，以NaOH为碱，丙二醇为溶剂，使山桐子油中的亚油酸异构化为共轭亚油酸。采用红外分光光度法和紫外分光光度法对制备的共轭亚油酸进行定性及定量分析，确定最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山桐子油：购于汉中市勉县；共轭亚油酸(纯度≥99%)：美国NU-CHEK公司；溴化钾：光谱纯；1,2-丙二醇、氢氧化钠、正己烷、盐酸、石油醚、乙醇：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

VGT-2227QTD型超声清洗仪 昆山禾创超声仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DHJF-8002低温恒温搅拌反应浴 郑州长城科工贸有限公司；MCR-3常压微波化学反应器 上海贝伦仪器设备有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；UV-2300紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；C92930红外光谱仪 美国Perkin-Elmer公司；SYP-24B型压片机 新诺仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 超声辅助山桐子油皂化并制备混合脂肪酸

按料液比1∶6 (g/mL)取山桐子油和质量分数为4%的氢氧化钠乙醇溶液于烧瓶中，充氩气保护，在60 ℃、功率500 W的超声条件下反应25 min后得皂化液，冷却后真空旋干乙醇，加适量水溶解，用1 mol/L盐酸调节pH至2～3。加石油醚萃取，水洗有机层至中性，提取滤液，加无水Na2SO4吸水干燥并过滤，旋干溶剂，得富含亚油酸的混合脂肪酸。

1.3.2 尿素包合法纯化亚油酸工艺

将体积分数95%的乙醇与尿素按照体积质量比11∶1(mL/g)加入烧瓶中，用磁力搅拌器缓慢搅拌升温至65 ℃，待尿素全部溶解后，按尿素和混合脂肪酸的质量比2∶1(g/g)加入混合脂肪酸，水浴回流40 min，冷却至室温后转入-5 ℃下包合10 h，取出反应物，并迅速减压抽滤，分离出滤液和尿素结晶物，将滤液旋干除去乙醇，加入适量水溶解，并用1 mol/L的盐酸调节pH约为2～3，加入石油醚萃取，水洗至中性，用Na2SO4脱水后旋干溶剂，得到分离后的亚油酸。

1.3.3 微波辅助碱异构化法制备共轭亚油酸

参考文献[15-16]中的方法，略作修改。将NaOH与丙二醇按一定质量比加入圆底烧瓶中，于60 ℃下完全溶解，再加入一定质量的亚油酸混匀后，放置于特定温度的微波反应器中异构化反应一定时间，冷却至室温，加入温水放置于60 ℃温度下使其完全溶解后，用1 mol/L盐酸调pH值为2。用正己烷萃取3次，并水洗有机相至中性，加Na2SO4干燥，旋干溶剂，称其质量，得共轭亚油酸产物。

式中：m1为LA的质量，mg；m2为共轭亚油酸产物的质量，mg；c1为亚油酸的纯度；c2为共轭亚油酸的纯度。

1.3.3.1 单因素试验

在丙二醇和LA的质量比4∶1、LA和NaOH的质量比2∶1、反应温度160 ℃、反应时间2 min的基础上，分别考察丙二醇和LA的质量比、LA和NaOH的质量比、反应温度和反应时间4个因素对共轭亚油酸的产率和纯度的影响[17-19]。

1.3.3.2 响应面分析试验[20-21]

在单因素试验的基础上，选取对响应值有显著影响的因素即丙二醇和LA的质量比、LA和NaOH的质量比、反应温度为考察因素，以共轭亚油酸纯度为响应值，结合Design Expert 11中的Box-Behnken设计原理，进行三因素三水平响应面分析试验设计，共17个试验点，见表1。

1.3.4 共轭亚油酸纯度的测定

参照文献[22]中的方法，略作修改。

1.3.4.1 标准曲线的制备

称取共轭亚油酸标准品用氩气吹扫至恒重26.8 mg，用正己烷定容至50 mL容量瓶中，配成536 μg/mL的储备液。稀释成12.864，10.72，8.576，7.504，6.432，5.36，4.288，2.144 μg/mL的标准溶液，在234 nm波长处测定其吸光值，得到标准曲线回归方程式。

1.3.4.2 紫外特征吸收峰的确定

将共轭亚油酸标准品溶液通过紫外分光光度仪在200～300 nm波长范围内进行波长扫描，从而确定共轭亚油酸的特征吸收峰所对应的波长。

1.3.4.3 样品的测定

称取10～30 mg样品于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度线，并稀释一定倍数至吸光值在0.2～0.8范围内。按照1.3.4.1的方法测得样品溶液中共轭亚油酸的吸光值，根据标准曲线回归方程计算共轭亚油酸的质量浓度，从而计算出样品溶液中共轭亚油酸的纯度。

1.3.5 红外光谱监测共轭异构体

分别称取150 mg溴化钾在高温灯下研磨，用红外压片机制备溴化钾盐窗，分别滴入1滴共轭亚油酸标准品、制备的亚油酸、制备的共轭亚油酸，再分别放于红外光谱仪下进行红外监测，得到相应的红外光谱图，判断亚油酸在1000～900 cm-1处的特征吸收带是否发生了裂分，从而监测共轭异构体的存在[23-24]。

1.4 数据处理

每组试验平行测定3次，计算平均值。将测得的数据采用Origin 2018软件分析并作图，运用Design Expert 11.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 丙二醇和LA的质量比对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

由图1可知，随着丙二醇质量的增加，共轭亚油酸的纯度和产率先升高后降低，在丙二醇和LA的质量比为4∶1时达到最大值。这可能是由于丙二醇用量过少时，与反应物接触不充分，反应不彻底，但当丙二醇用量过度时，降低了反应体系间的浓度，从而降低了分子间相互接触。因此，选择丙二醇和LA的质量比4∶1较为合适。

图1 丙二醇和LA的质量比对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

2.1.2 LA和NaOH的质量比对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

由图2可知，随着LA和NaOH的质量比的增大，共轭亚油酸的纯度和产率先升高后降低，在2∶1时达到最大值。这可能是由于NaOH用量少时，不能使反应物充分皂化，反应不彻底，而过度增加NaOH用量会造成反应过程中起泡性高，色泽偏黄。因此，选择 LA和NaOH的质量比2∶1较为合适。

图2 LA和NaOH的质量比对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

2.1.3 反应温度对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

由图3可知，共轭亚油酸的纯度和产率随着反应温度的升高而先升高后降低，在160 ℃时达到最大值。这可能是由于随着反应温度的升高，亚油酸逐渐共轭化，在一定温度下完全反应，而过高温度会导致产物的破坏甚至生成其他副产物。因此，选择160 ℃作为后续反应条件。

图3 反应温度对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

2.1.4 反应时间对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

由图4可知，共轭亚油酸的纯度和产率随着反应时间的增加而先升高，在2 min时达到最大值，而继续增加反应时间，亚油酸共轭化速率变慢甚至略有降低。这可能是由于适当的反应时间能增加分子间的相互接触而使反应彻底，但长时间高温反应，易破坏产物的化学结构。因此，选择2 min较为合适。

图4 反应时间对共轭亚油酸的产率和纯度的影响

续 表

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

结合单因素试验，综合考虑，选取具有明显响应效果的丙二醇和LA的质量比(A)、LA和NaOH的质量比(B)和反应温度(C)3个因素进行三因素三水平试验，进行Box-Behnken中心组合试验设计和响应面分析，从而确定共轭亚油酸制备工艺的最佳条件。响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 拟合模型的建立及方差分析

利用Design Expert 11.0软件对实验结果进行多元回归分析，建立二次响应模型，根据表3的显著性分析，得到以共轭亚油酸的纯度为响应值(Y)的二次多元回归方程：Y=97.09+10.01A+9.32B+6.10C-25.23AB-9.8AC-6.75BC-20.32A2-20.23B2-11.61C2。该模型差异极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，R2=0.9976。表明该模型拟合度良好，可利用该回归方程分析各因素对共轭亚油酸纯度的影响。同时结合F值，分析判断各因素对共轭亚油酸纯度的影响关系为A>B>C。而交互因素对共轭亚油酸纯度的影响为AB>AC>BC。

表3 CLA纯度的响应面模型方差分析结果

2.2.3 响应面分析

利用Design Expert 11.0软件模拟得到相应的三维响应面图和等高线图，能够直观地评价各因素之间相互作用对共轭亚油酸纯度的影响。各三维图均呈现下凹的趋势，共轭亚油酸的纯度随着丙二醇和LA的质量比、LA和NaOH的质量比、反应温度的增大而先升高后降低，说明具有极大值,见图5。根据三维响应面原理，三维图向下凹的趋势越明显，等高线呈椭圆形，交互作用越显著，即丙二醇和LA的质量比、LA和NaOH的质量比对共轭亚油酸纯度的影响极显著，其次是反应温度。

图5 各因素交互作用对CLA纯度影响的响应面图和等高线图

2.2.4 验证试验

根据Box-Behnken模型所预测的最佳异构化工艺条件为丙二醇和LA的质量比4.058∶1、LA和NaOH的质量比2.227∶1、反应温度163.310 ℃。综合考虑试验的实际操作性，确定共轭亚油酸的异构化工艺条件为丙二醇和LA的质量比4∶1、LA和NaOH的质量比2∶1、反应温度163 ℃。以最佳工艺条件进行6次平行试验并计算平均值，得到共轭亚油酸的纯度为(93.78±1.86)%，产率为(89.15±1.28)%。预测值与实际值的偏差均小于5%，表明此优化工艺可行。

2.3 共轭亚油酸的测定

2.3.1 紫外特征吸收峰的确定

由图6可知，共轭亚油酸标准品在234 nm处有紫外特征吸收峰。因此，确定在234 nm波长处对共轭亚油酸进行定性和定量分析。

图6 CLA标准品的紫外光谱图

2.3.2 共轭亚油酸标准曲线的制作

由图7可知，以吸光值为纵坐标(Y)，共轭亚油酸标准品的不同浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程为Y=0.0925X+0.0998，R2=0.9996，线性良好，可作为共轭亚油酸的标准曲线。

图7 CLA标准曲线

2.3.3 共轭异构体的监测

由图8可知，反应物亚油酸在234 nm处无特征吸收峰，而共轭亚油酸产物在234 nm处有明显特征吸收峰，与共轭亚油酸标准品的紫外特征吸收峰一致，表明亚油酸发生了异构化，产生了共轭亚油酸产物。另外，由图9可知，亚油酸在1000～900 cm-1处的特征吸收带发生了裂分，在981 cm-1和948 cm-1处出现两个明显的特征吸收带，表明有共轭反式异构体的存在，而共轭亚油酸产物与共轭亚油酸标准品的红外光谱图基本一致，证实了共轭亚油酸产物的存在。

图8 LA和CLA产物的紫外光谱图

图9 LA、CLA标准品和CLA产物的红外光谱图

3 结论

本研究以山桐子油制备的亚油酸为原料，NaOH为碱，丙二醇为溶剂，在微波加热下进行异构化，利用紫外分光光度法，在单因素试验基础上结合响应面法得到最佳工艺条件为丙二醇和LA的质量比4∶1、LA和NaOH的质量比2∶1、反应温度163 ℃，得到共轭亚油酸的纯度为(93.78±1.86)%，产率为(89.15±1.28)%。结合红外光谱图和紫外光谱图，确定亚油酸被异构化，产生共轭双键异构体。

共轭亚油酸广泛运用于食品、药品、化妆品等行业，在食品保健方面尤为突出，经济效益显著。山桐子作为共轭亚油酸的新型制备原料，产量大，成本低廉，可用于工业化生产，具有一定的开发价值。